拟南芥中昼夜节律钟蛋白 PRR 通过 RHD6/RSL 模块调控根毛发育

《Plant Science》：The circadian clock proteins PRR modulate root hair development via the RHD6/RSL module in Arabidopsis

　　

摘要 根毛来源于毛状原细胞，对植物生长和环境适应至关重要。尽管已知环境信号会影响根毛发育，但诸如昼夜节律等内源计时系统如何整合到控制根毛形成的核心转录网络中仍不清楚。在此，我们表明昼夜节律相关蛋白 PSEUDO-RESPONSE REGULATOR5 (PRR5) 与根毛起始必需的两个基本螺旋 - 环 - 螺旋转录因子 ROOT HAIR DEFECTIVE6 (RHD6) 和 RHD6 LIKE1 (RSL1) 发生物理相互作用。遗传分析表明，PRR 蛋白在拟南芥长日照条件下有助于根毛发育。同时破坏 PRR5、PRR7 和 PRR9 会导致根毛缺陷，而 PRR5 过表达则显著增加根毛密度和长度。转录组和 RT-qPCR 分析揭示，PRRs 增强 RHD6、RSL1 及多个下游根毛响应基因的表达，同时调节其时间表达模式。此外，PRR5 介导的根毛促进需要 RHD6/RSL1，且 PRR 蛋白增强 RHD6 依赖性激活的 RSL4 启动子。PRRs 也在磷缺乏和盐胁迫条件下有助于根毛发育。总之，这些发现确立了一个分子框架，即 PRR 蛋白调节 RHD6/RSL 网络以协调根毛发育和环境响应。

引言 根毛形成于毛状原细胞向外凸起和伸长时，有效扩大了根与周围环境之间的接触面积。根毛对于营养吸收、微生物相互作用和植物固定至关重要 (Grierson 等，2014)。在拟南芥中，根表皮细胞命运是位置依赖性的：位于内层两个细胞之间的表皮细胞将发育成根毛细胞（称为"H 细胞”，位于"H 位置”），而仅依靠其中一个内层细胞的表皮细胞是无根毛细胞（称为"N 细胞”，位于"N 位置”）(Grierson 等，2014)。这种细胞命运决定模式部分由不同表皮细胞中形成不同的 WD-bHLH-MYB 转录复合物引起的分子反馈调节回路决定 (Grierson 等，2014; Qiu 等，2021; Zhang 等，2022)。

在 N 位置，R2R3 型 MYB 蛋白 WEREWOLF (WER)，与含有 bHLH 结构域的蛋白 GLABRA3 (GL3)/ENHANCER OF GL3 (EGL3) 以及 WD40 蛋白 TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1) 一起形成转录因子复合物 (Galway 等，1994; Bernhardt 等，2005; Ryu 等，2005; Schiefelbein 等，2009)。该复合物共同激活 GLABRA2 (GL2) 基因（已知该基因抑制根毛生长）的表达 (Lee 和 Schiefelbein, 1999; Payne 等，2000; Bernhardt 等，2003; Kang 等，2009)。与此同时，R3-MYB 蛋白 CAPRICE (CPC)、TRIPTYCHON (TRY) 和 ENHANCER OF TRY AND CPC1 (ETC1) 在 H 位置与 WER 竞争时处于优势地位，从而取代 WER 形成不同的复合物，无法促进 GL2 表达 (Grierson 等，2014)。同源域 - 亮氨酸拉链蛋白 GL2 在 N 细胞建立和抑制根毛形成中起关键作用 (Rerie 等，1994; Di Cristina 等，1996; Salazar-Henao 等，2016)，通过调节一系列 bHLH 家族基因的表达 (Bruex 等，2012; Lin 等，2015)。其中，bHLH 第 VIII 亚家族 ROOT HAIR DEFECTIVE6 (RHD6) 对根表皮细胞分化和根毛起始至关重要 (Schiefelbein 和 Somerville, 1990; Masucci 和 Schiefelbein, 1996; Bruex 等，2012)。RHD6 主要在 H 细胞中表达，是根毛形成不可或缺的，因为 rhd6 功能缺失植物表现出根毛缺乏 (Masucci 和 Schiefelbein, 1994)。RSL1 与 RHD6 平行作用，促进根毛形成 (Menand 等，2007)。RSL2、RSL3、RSL4 和 RSL5 在根毛发育中发挥类似作用，其表达受 RHD6 和 RSL1 激活 (Yi 等，2010; Pires 等，2013)。

根据最近的研究，植物激素（例如乙烯、生长素、油菜素内酯、细胞分裂素或茉莉酸）、营养缺乏（例如氮或磷）、温度、活性氧 (ROS)、pH 值和钙振荡等多种因素影响根毛发育 (Müller 和 Schmidt, 2004; Monshausen 等，2007; Yang 等，2008; Lee 和 Cho, 2013; Cheng 等，2014; Datta 等，2015; Zhang 等，2016; Feng 等，2017; Mangano 等，2017; Han 等，2020; Kim 等，2021; Ying 和 Scheible, 2022; Han 等，2023; Yin 等，2024; Berdion Gabarain 等，2025; Chen 等，2025; Ke 等，2025)。尽管对根毛生长及其与其他关键信号的相互作用进行了广泛研究，但昼夜节律与根毛生长之间的相互作用及潜在分子机制仍知之甚少。

昼夜节律是一种内在计时机制，协调高等植物中与外部昼夜循环同步发生的生理过程 (Dunlap, 1999; Dodd 等，2005; Pruneda-Paz 和 Kay, 2010; Atkins 和 Dodd, 2014; Grundy 等，2015; Webb 等，2019; Liu 等，2020; He 等，2022; Wang 等，2022; Yan 等，2025)。昼夜节律整合多种信号以影响各种植物生理过程，如种子萌发、光形态建成、叶片衰老和开花 (Nakamichi 等，2005; Zhang 等，2018; Nohales 和 Kay, 2019; Kim 等，2020; Yang 等，2021; Cai 等，2023; Du 等，2024; Wang 等，2024; Tang 等，2025)。此外，昼夜节律已被证明参与冷胁迫、盐胁迫响应、铁稳态、耐脱水和渗透平衡的调节 (Kreps 等，2002; Sakuraba 等，2017; Xu 等，2019; Kidokoro 等，2021; Wang 等，2021; Cha 等，2022; Yi 等，2022; Du 等，2023; Liu 等，2026a; Liu 等，2026b)。

拟南芥的核心昼夜节律振荡器包括 MYB 转录因子 CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED1 (CCA1) 和 LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY)，以及 PSEUDO-RESPONSE REGULATOR5 (PRR5)、PRR7、PRR9 和 TIMING OF CAB EXPRESSION1 (TOC1) 蛋白。这些蛋白形成转录 - 翻译反馈回路：CCA1 和 LHY 直接抑制 PRR5、PRR7、PRR9 和 TOC1，因此直到 LHY 和 CCA1 蛋白水平降低时这些基因才开始表达 (Wang 和 Tobin, 1998; Pokhilko 等，2012; Carré 和 Veflingstad, 2013; Greenham 和 McClung, 2015; Uehara 等，2019; Nakamichi, 2020)，而 PRR 蛋白反过来抑制 LHY 和 CCA1 的转录直到第二天早晨 (Harmer 等，2000; Matsushika 等，2000; Alabadí 等，2001; Perales 和 Más, 2007; Farré 和 Liu, 2013; Adams 等，2015; Li 等，2020a; Li 等，2020b)。

作为振荡器内关键的转录抑制因子，PRR5、PRR7 和 PRR9 调节多种白天气生理过程，包括氧化应激反应、气孔开放和耐冻性 (Strayer 等，2000; Harmer, 2009; Nakamichi 等，2010; Nakamichi 等，2012; Kim 等，2024; Liang 等，2024)。除了核心时钟调节外，PRRs 还与 SPINDLY (SPY)、B-BOX DOMAIN PROTEIN19 (BBX19) 转录因子和 CALMODULIN LIKE PROTEIN9 (CML9) 等蛋白相互作用以微调昼夜节律 (Perochon 等，2010; Wang 等，2020; Yuan 等，2021)，抑制 TANDEM ZINC FINGER1 (TZF1) 表达并减弱 Target of Rapamycin (TOR) 信号以正向调节拟南芥根分生组织细胞增殖 (Li 等，2019)。最近发现，PRR5 与 ABA INSENSITIVE5 (ABI5) 相互作用以调节脱落酸 (ABA) 介导的种子萌发过程 (Yang 等，2021)。

在本研究中，我们旨在阐明昼夜节律 PRR 蛋白在根毛形成中的调节机制。我们证明 PRR5 与根毛调节转录因子 RHD6 和 RSL1 发生物理相互作用。表型分析显示，prr5 prr7、prr5 prr9 双突变体以及 prr5 prr7 prr9 三突变体表现出严重的根毛缺乏。相反，PRR5 的过表达导致更多且更长的根毛。进一步的遗传分析表明，PRR5 过表达植物根毛生长的促进需要功能性的 RHD6 和 RSL1。在机制水平上，PRR5 调节根毛相关基因的时间表达模式，并在瞬时报告基因检测中增强 RHD6 依赖性激活的 RSL4 启动子。令人惊讶的是，我们还发现这些 PRR 蛋白在磷 (Pi) 缺乏条件和盐胁迫下有助于根毛生长。总之，这些发现确立了一个遗传和分子框架，即 PRR 蛋白与 RHD6/RSL 转录网络相互作用，以在长日照条件下调节根毛发育和环境响应性。

章节片段 RHD6 和 RSL1 与 PRR 蛋白发生物理相互作用 RHD6 和 RSL1 是根毛起始和伸长的核心调节因子 (Masucci 和 Schiefelbein, 1994; Masucci 和 Schiefelbein, 1996; Menand 等，2007; Bruex 等，2012)。先前的研究表明，RHD6 与其他调节蛋白（如 JAZ 和 EIN3）相互作用，在根毛发育期间整合多种信号通路 (Feng 等，2017; Han 等，2020)。为了检查 PRR 蛋白是否与根毛调节机制相关联，在

讨论 在植物中，昼夜节律同步各种体内生理过程与外部昼夜周期 (Fukushima 等，2009; Hsu 和 Harmer, 2014; Sanchez 和 Kay, 2016; Frank 等，2018; Simon 等，2020)。在这些过程中，PRR 蛋白在调节昼夜节律对植物生理反应的影响中起关键作用。具体来说，PRR 蛋白通过调节 C-重复结合因子/脱水响应

材料与植物生长条件 本研究中使用的 Taq DNA 聚合酶购自大连宝生物工程有限公司（中国大连）。所有其他标准化学品均购自上海生工（中国上海）。本研究中使用的拟南芥突变体和过表达系均在 Col-0 遗传背景下生成。prr5-1、prr5-2、prr7-1、prr7-2 和 prr9 突变体购自俄亥俄州立大学拟南芥资源中心（http://abrc.osu.edu）。prr5-1 prr9-1 (prr5 prr9)、prr5-1 prr7-2

结论 我们的研究不仅确定了 PRR 蛋白在长日照条件下调节拟南芥根毛发育的先前所未知的角色，还阐明了 PRR5 与 RHD6 和 RSL1 相互作用以调节 RHD6/RSL 转录模块的分子机制。此外，我们证明 PRR 蛋白有助于在磷缺乏和盐胁迫条件下对根毛生长的适应性调节，从而为 PRR 介导的

统计分析 所有统计分析均使用 ANOVA 进行，随后使用 Tukey 多重比较检验评估组间差异。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。柱状图上方的不同小写字母表示样本间存在统计学显著差异。详细的统计结果见补充数据集 S2。

登录号 本文讨论的基因的拟南芥基因组计划识别号如下：PRR5, AT5G24470; PRR7, AT5G02810; PRR9, AT2G46790; RSL1, AT5G37800; RSL2, AT4G33880; RSL3, AT2G14760; RSL4, AT1G27740; RSL5, AT5G43175; RHD6, AT1G66470; LRX1, AT1G12040; RHS10, AT1G70460; EXPA7, AT1G12560; 和 ACTIN2, AT3G18780。

资助 本工作由国家自然科学基金（资助号 U2571221 和 32400265）、江苏省高校自然科学研究项目（24KJB180009）、湖南省自然科学基金（资助号 2024JJ3007）、岳麓山实验室培育项目（资助号 YLS-2025-ZY03009）以及湖南省科技创新计划（资助号 2025ZYJ003）资助。

CRediT 作者贡献声明 李敏辰：写作 - 审阅与编辑，数据管理。王天美：写作 - 审阅与编辑，可视化，验证，数据管理。赵燕：写作 - 审阅与编辑，写作 - 原稿，形式分析，数据管理。白宁：写作 - 原稿，形式分析，数据管理。叶亚进：写作 - 审阅与编辑，项目管理。周丽娟：写作 - 审阅与编辑。杨米莲：写作 - 审阅与编辑，数据管理。韩肖：写作 - 审阅与编辑。利益冲突声明 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报道的工作。

致谢 我们感谢中国科学院植物研究所的王磊，以及南方科技大学的郭宏伟分享研究材料。我们感谢俄亥俄州立大学拟南芥资源中心提供 prr5、prr7 和 prr9 突变体种子。

利益冲突声明 所有作者声明他们与本研究没有任何利益冲突。

白宁|赵燕|王天美|李敏辰|韩肖|杨米莲|周丽娟|叶亚进|张志强|胡燕茹|何坤荣
林木食品资源开发与利用国家重点实验室，南方可持续林业协同创新中心，南京林业大学，南京，210037，中国