《Cells》：MAP3K1 Integrates Genetic and Environmental Signals in Eyelid Morphogenesis
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发育障碍通常源于遗传变异与环境因素之间的复杂相互作用，但基因-基因（G × G）和基因-环境（G × E）相互作用的潜在分子机制仍知之甚少。小鼠胚胎眼睑闭合为研究这些机制提供了一个易于进行遗传操作的在体模型。眼睑闭合需要由相互连接的信号通路协调的上皮细胞迁移和
发育障碍通常源于遗传变异与环境因素之间的复杂相互作用，但基因-基因（G × G）和基因-环境（G × E）相互作用的潜在分子机制仍知之甚少。小鼠胚胎眼睑闭合为研究这些机制提供了一个易于进行遗传操作的在体模型。眼睑闭合需要由相互连接的信号通路协调的上皮细胞迁移和细胞骨架重塑。在这些通路中，MAP3K1作为关键的信号枢纽，整合来自S1PR-RHOA-ROCK及其他上游调节因子的输入信号，以激活JNK并促进眼睑闭合。遗传学研究表明，GPCR-RHOA-ROCK-MAP3K1-JNK网络内的多个组分协同维持发育鲁棒性。剂量依赖性地降低通路组分活性会损害眼睑闭合，并产生具有特征性的出生时眼睑未闭（EOB）表型。环境因素也汇聚于该网络。尽管暴露于二噁英不会损害野生型胚胎的眼睑闭合，但它会在携带MAP3K1网络中其他表型沉默突变的胚胎中诱发EOB，例如Map3k1+/?、Jnk1?/?和S1pr2?/?。这些发现证实了MAP3K1通路是遗传和环境信号的汇聚点，并确立了胚胎眼睑闭合作为一个用于阐明发育鲁棒性、易感性和恢复力潜在分子机制的有力模型。
1. Introduction
理解人类疾病的原因需要综合考虑遗传易感性和环境暴露因素。随着全基因组关联研究、全外显子组测序和全基因组测序技术的发展，已鉴定出数千种与人类疾病和发育障碍相关的遗传变异。然而，这些遗传变异的生物学效应往往受到更广泛基因组背景中其他变异的上位性相互作用影响。因此，疾病易感性是由众多变异通过相互连接的分子通路共同作用决定的。环境因素同样是决定易感性的重要决定因素，细胞和组织在整个生命周期中持续暴露于化学毒物、感染因子等环境影响因素中。个体在相似环境条件下表现出不同的生物学结果，凸显了遗传背景在环境反应中的作用。遗传与环境因素之间的相互作用被广泛认为是复杂疾病的关键决定因素。G × G相互作用塑造了遗传变异组合如何影响生物学功能，而G × E相互作用则决定了环境暴露如何显现、放大或减轻遗传易感性。这些效应可能是在遗传和环境扰动汇聚于共同决定维持稳态能力的相互连接的信号网络时产生的。小鼠胚胎眼睑闭合为研究这些机制提供了合适的在体模型，该过程依赖于上皮迁移、细胞骨架重塑和组织融合，其失败会导致易于识别的EOB表型。MAP3K1被鉴定为整合多种发育输入信号的中心信号枢纽。研究人员总结了当前关于胚胎眼睑闭合调控机制的知识，重点关注以MAP3K1为中心的信号网络。
2. Embryonic Eyelid Closure as a Model of Developmental Robustness and Susceptibility
胚胎发育过程中上下眼睑的短暂融合是哺乳动物眼部发育的保守特征。在小鼠中，眼睑形态发生始于胚胎期第11.5天（E11.5），背侧和腹侧眼表面外胚层内陷形成原基眼睑褶皱。这些褶皱随后生长并延伸跨越发育中的眼球。在E15.5至E16.0之间，相对的眼睑边缘在中线相遇并融合，形成暂时性的上皮封闭以保护角膜。融合的眼睑在妊娠晚期保持闭合，并在出生后约两周通过涉及上皮分化（即角化）和融合连接处细胞凋亡的发育程序性过程重新开放。胚胎眼睑闭合失败会导致易于识别且非致命的EOB表型。尽管眼睑闭合在形态学上看似简单，但它需要包括上皮增殖、迁移、分化、细胞间黏附、细胞骨架重塑和组织融合在内的多种细胞过程的协调作用，这些过程由相互连接的信号网络控制，网络破坏会导致眼睑闭合受损并引发EOB表型。
3. Signaling Control of Embryonic Eyelid Closure
遗传学研究鉴定出越来越多的可导致EOB表型的突变。这些基因编码细胞外配体、细胞表面受体、转录因子、细胞骨架调节因子和胞内信号分子。尽管功能多样，但许多与EOB相关的基因汇聚于有限的几条信号通路上，包括EGF、TGFβ/BMP、FGF、GPCR、WNT/平面细胞极性（PCP）、整合素和MAPK信号传导。
3.1. EGFR Signaling Defines Pathway Regulation of Eyelid Morphogenesis
EGFR信号通路提供了一个典型的例证，说明通路内的协调调控如何决定发育结果。在眼睑形态发生过程中，由表面上皮和邻近间充质产生的EGFR配体激活前缘上皮中的EGFR。这种信号传导促进上皮增殖、定向迁移、细胞骨架重塑以及富含肌动蛋白的突起形成，从而驱动眼睑延伸和融合。破坏EGFR及其配体、配体脱落蛋白酶ADAM17、其调节因子RHBDF1和RHBDF2，或下游效应因子（包括GAB1、SHP2、RAF1和MAP2K1/2）均会损害眼睑闭合并导致EOB表型。遗传分析进一步表明，信号输出由多个通路组分的联合活性和剂量决定。单独缺失某个配体通常影响甚微，而多种配体同时减少或配体与受体活性联合受损则会显著增加EOB外显率。相反，通路过度激活也会破坏形态发生。这表明成功的眼睑闭合需要对EGFR信号进行精确的定量控制，通路活性不足或过度均会破坏正常发育。
3.2. MAP3K1-JNK Signaling Is a Core Morphogenetic Module
EGFR信号凸显了通路贡献的重要性，而MAP3K1信号则提供了分子输入如何整合入网络的深入见解。MAP3K1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，将多种上游信号与MAPK信号传导连接起来，并协调转录和细胞骨架反应。在其发育功能中，对胚胎眼睑闭合的调节是最一致观察到的结果。多种独立的小鼠模型，包括Map3k1敲除（Map3k1
?/?）、激酶缺陷型（Map3k1
ΔKD/ΔKD）和自发性截短突变体，均表现出完全外显的EOB表型，确立了MAP3K1在眼睑形态发生中的关键作用。在眼睑发育过程中，MAP3K1在迁移的前缘上皮中高表达，促进角质形成细胞中的JNK激活。激活的JNK磷酸化c-JUN及其他下游效应因子，以调节基因表达、肌动蛋白重塑、细胞间黏附和上皮迁移。MAP3K1缺失会降低JNK和c-JUN磷酸化，破坏肌动蛋白组织，并损害眼睑边缘的上皮迁移。破坏JNK信号同样会导致EOB。遗传相互作用研究支持MAP3K1与JNK之间的功能合作，两者活性的同时降低会产生具有不同外显率和严重程度的EOB表型，表明它们在同一通路中共同维持眼睑闭合所需的信号输出。相比之下，c-JUN杂合性并不会增强Map3k1或Jnk突变体的表型，表明c-JUN剂量在眼睑闭合的MAP3K1-JNK信号传导中可能不是限速的。
3.3. GPCR Signaling Provides Major Inputs to the MAP3K1-JNK Module
遗传相互作用研究进一步支持了MAP3K1与GPCR信号之间的功能关系。在参与眼睑闭合的GPCR中，鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）研究最为透彻。S1PR2和S1PR3冗余地调节上皮迁移和组织融合，两者同时缺失会导致EOB表型。缺失转运S1P至胞外空间的SPNS2也会破坏眼睑闭合。遗传和生化证据将MAP3K1置于S1PR信号的下游。在培养的角质形成细胞中，MAP3K1缺失会减弱S1P诱导的JNK激活和上皮迁移。在体内，S1PR2或S1PR3的部分缺失会增强Map3k1和Jnk1突变体中的EOB表型。这些发现支持存在促进眼睑闭合所需上皮迁移的S1PR-MAP3K1-JNK功能轴。另一个参与眼睑闭合的GPCR是LGR4。LGR4通常被认为是R-响应蛋白的受体，通过稳定卷曲蛋白-LRP5/6受体复合物并拮抗ZNRF3/RNF43介导的受体更新来增强经典WNT信号传导。然而，其在眼睑形态发生中的功能似乎超出了经典WNT信号传导的范畴。遗传相互作用研究表明，Lgr4突变会增强Map3k1、S1pr和Rhoa突变体的EOB表型，表明LGR4参与了调节眼睑形态发生的网络。尽管有这些遗传相互作用，但将LGR4与MAP3K1信号传导直接联系起来的生物学证据仍然有限。
3.4. RHOA-ROCK Signaling Links GPCR Activation to MAP3K1
连接GPCR信号与MAP3K1的关键中间体是RHOA-ROCK通路。RHOA是一种小GTP酶，通过其下游效应因子ROCK1和ROCK2调节肌球蛋白收缩性、黏着斑成熟、应力纤维组装和细胞张力。这些细胞骨架过程产生形态发生过程中上皮迁移和组织重塑所需的机械力。Rock1和Rock2的联合缺失导致完全外显的EOB。同样，单独RHOA缺失对眼睑发育影响极小，但与Rock1突变结合时会导致严重的闭合缺陷。多项证据将RHOA-ROCK信号定位于GPCR-MAP3K1网络内。RHOA或ROCK活性的部分降低会增强与S1pr2/3、Lgr4和Map3k1突变相关的眼睑缺陷。在培养的角质形成细胞中，S1P刺激激活JNK，诱导c-JUN磷酸化和AP-1转录活性，促进Paxillin磷酸化并增强定向迁移。这些反应需要RHOA、ROCK和MAP3K1的参与。反之，MAP3K1也参与RHOA依赖性黏着斑信号传导，这表明细胞骨架与MAPK信号之间存在双向通讯。近期的邻近标记研究为该信号网络提供了额外证据。基于TurboID的蛋白质组学分析在MAP3K1相关蛋白中鉴定出Gβ2和多种Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子，这些蛋白质可能将GPCR激活与RHOA和MAP3K1信号传导连接起来。
4. Defining Signaling Networks Through Genetic Interaction Studies
遗传相互作用分析为理解基因间的功能关系提供了一种强大的在体方法。当基因产物在同一生物学通路或形成共同分子复合物时，相应基因的突变可能表现出非等位非互补性，即单独存在时温和或沉默的突变在组合后产生更严重的表型。胚胎眼睑闭合为检测此类相互作用提供了一个特别敏感的模型。该模型可揭示信号组分间的功能关系。利用该模型的研究揭示了EGF、BMP、S1PR、ROCK、JNK和转录因子家族内旁系同源基因之间的广泛相互作用。涉及S1prs、Lgr4、Rhoa、Rock1、Map3k1和Jnk1的组合突变产生EOB，而单个突变通常被耐受。这些网络特异性相互作用的一个显著特征是发育结果的范围，从正常闭合到延迟闭合、不完全融合和完全外显的EOB。表型严重程度与磷酸化JNK（p-JNK）水平呈负相关，表明逐渐降低的JNK信号导致了越来越严重的闭合缺陷。因此，EOB表型不仅是形态学终点，还提供了信号传导活性的敏感功能读数。这些观察结果支持发育鲁棒性的阈值模型概念，即当整合的信号输出保持在临界水平以上时，才能维持成功的眼睑形态发生。随着遗传扰动的积累，信号传导能力可能逐渐下降，增加发育失败的可能性和严重程度。该模型为G × G相互作用如何影响表型结果以及环境暴露如何进一步降低信号传导能力以通过G × E相互作用改变发育易感性提供了潜在解释。
5. Environmental Perturbation of the MAP3K1 Network
尽管胚胎眼睑闭合受遗传程序控制，但它对环境影响因素仍具有高度反应性。许多药物、毒物和母体暴露可破坏眼睑形态发生并在小鼠中诱发EOB。这种环境敏感性使眼睑闭合模型非常适合研究G × E相互作用。当一种在正常条件下几乎没有影响的变异增加了对其他可耐受环境挑战的易感性时，就会发生G × E相互作用。G × E调节的一个特别具有启发性的例子涉及芳烃受体（AHR）通路。二噁英类化合物是持久性环境污染物，主要通过激活AHR发挥其生物学效应。配体结合后，AHR转位至细胞核，与芳烃受体核转位蛋白（ARNT）二聚化，并调节参与异生物代谢、细胞分化和发育信号传导的转录程序。在环境AHR配体中，2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英（TCDD）被广泛用作研究AHR介导发育毒性的原型化合物。使用眼睑闭合模型的研究揭示了TCDD-AHR信号传导与MAP3K1网络之间的选择性相互作用。单独暴露于TCDD不会损害野生型胚胎的眼睑闭合。然而，它在携带Map3k1、S1pr2、S1pr3、Rhoa、Rock1、Lgr4和Jnk1本来沉默突变的胚胎中呈剂量依赖性地诱发EOB。相比之下，该网络外的基因突变不会赋予对TCDD的类似敏感性。这些发现表明，TCDD并不广泛损害眼睑发育，而是选择性地破坏依赖于MAP3K1信号模块的发育程序。多项证据表明AHR激活是这种反应的启动事件。TCDD在发育中的眼睑上皮中强烈诱导经典AHR靶基因，而Ahr缺失在很大程度上消除了遗传致敏胚胎中由TCDD诱导的EOB。此外，易感性与AHR配体结合亲和力密切相关。AHR激活随后扰乱调节形态发生的信号通路。TCDD诱导EGFR配体表达并延长ERK激活，从而导致JNK依赖性信号传导的抑制。这种降低在遗传正常的胚胎中是可以耐受的，但当MAP3K1通路活性已因遗传扰动而降低时，其影响便变得显著。在致敏胚胎中，TCDD诱导的EGFR-ERK信号激活进一步降低JNK通路输出，可能使其低于上皮迁移和组织融合所需的阈值，从而导致眼睑闭合失败。伴随着这些信号改变，上皮行为也发生变化。TCDD增加上皮分化标志物的表达，同时抑制迁移相关程序。因此，环境暴露可通过进一步降低信号输出至成功形态发生所需水平之下，从而揭示原本沉默的遗传脆弱性。
6. Perspectives and Future Directions
对胚胎眼睑闭合的研究已确立MAP3K1作为上皮形态发生的关键调节因子。遗传和分子研究将MAP3K1定位于连接GPCR、RHOA-ROCK和JNK通路的信号网络中，这些通路控制着眼睑闭合所需的细胞行为。对该网络的研究进一步表明，遗传扰动和环境暴露可汇聚于信号输出以决定发育结果。因此，眼睑闭合模型为理解G × G和G × E相互作用如何增加对发育失败的易感性提供了一个易于操作的系统。尽管取得了这些进展，但MAP3K1网络的组织仍不完全明确。关键问题包括上游受体和细胞骨架信号如何汇聚于MAP3K1、其活性在形态发生过程中如何受空间和时间调控等。解决这些问题需要将小鼠遗传学与定量成像、蛋白质组学、单细胞技术和网络分析相结合。Cre诱导的TurboID标记的MAP3K1小鼠模型能够在天然细胞背景下进行细胞类型特异性邻近标记并检测信号复合物。初步研究已鉴定出异三聚体G蛋白组分、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子、黏着斑蛋白和肌动球蛋白调节因子等MAP3K1相关蛋白。将邻近蛋白质组学与遗传和功能研究相结合应有助于确定该网络在形态发生过程中的组织和功能。下一步的重要工作是确定MAP3K1如何将机械力与细胞内信号耦合。RHOA依赖性收缩、黏着斑重塑和组织力学似乎影响MAP3K1活性。然而，这些机械输入如何被感知并转化为MAP3K1信号在很大程度上仍属未知。眼睑闭合模型还为在信号网络水平研究环境易感性提供了独特平台。TCDD研究表明，环境暴露可以选择性地破坏遗传致敏通路，而不是广泛损害发育。这种方法可扩展到多氯联苯、多环芳烃等额外AHR配体和新兴环境污染物。系统分析这些暴露如何影响EGFR、GPCR、WNT、TGFβ/BMP通路可能揭示环境诱发发育障碍的更广泛机制。将这些发现转化为人类生物学是一项重大挑战。尽管眼睑融合在人类发育过程中短暂发生且原发性眼睑闭合缺陷并不常见，但控制这一过程的通路破坏可能导致更广泛的眼部和颅面异常。此外，人类遗传学研究已将MAP3K1与性发育障碍、听力受损、癌症和组织重塑联系起来。因此，通过眼睑形态发生揭示的机制可能具有超越该模型的适用性。它们可能有助于解释MAP3K1如何整合遗传变异、环境影响和细胞背景以影响发育和疾病结果。
