降低乳清蛋白-大豆蛋白体系致敏性的发酵菌株筛选及所选菌株的基因组学表征

《Foods》：Screening of Fermentative Strains for Reducing the Allergenicity of a Whey Protein–Soy Protein System and Genomic Characterization of the Selected Strain

　　

结合乳清分离蛋白（WPI）和分离大豆蛋白（SPI）的双蛋白体系提供了互补的营养益处，但受到主要过敏原存在的限制。乳酸菌（LAB）发酵提供了一种缓解这一限制的有前途的策略。研究人员基于表型筛选从13株LAB菌株中选出的Lacticaseibacillus paracasei JM053显著降低了双蛋白体系的体外致敏性，将IgE（免疫球蛋白E）结合抑制率提高到48.75%。对JM053进行全基因组测序和表征揭示了一个全面的蛋白水解系统，包括脯氨酸特异性肽酶基因pepX和pepQ，这可能有助于致敏肽序列的降解。结合计算机生物信息学分析，基于已识别蛋白酶的底物特异性，研究人员预测了双蛋白体系线性表位内的潜在切割位点，为该菌株的作用机制提供了可检验的假设。此外，体外安全性评估和基因组分析支持了JM053的安全性潜力、抗逆性和益生菌特性。总的来说，这项研究为低致敏性双蛋白产品的开发提供了有价值的候选菌株，并为LAB介导的致敏性降低提供了初步的基因组学见解。

蛋白质是维持人类生理功能的核心营养素。随着消费者对营养健康食品需求的增长，单一来源蛋白质的局限性日益明显。WPI和SPI是代表性的优质动植物蛋白，但前者受限于资源和高成本，后者虽成本低廉但缺乏某些必需氨基酸并含有抗营养因子。将两者结合形成双蛋白体系不仅能缓解供应压力、优化氨基酸谱，还能提升消化率。然而，WPI中的β-Lg（β-乳球蛋白）和α-La（α-乳白蛋白）以及SPI中的大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S）被广泛认为是过敏原。摄入这些蛋白可能引发敏感人群从皮疹到危及生命的过敏性休克等不良反应。因此，结合两者可能扩大过敏人群范围，严重限制其工业应用。目前，加热、酶解、微生物发酵等多种加工技术可修饰蛋白质的表位以降低致敏性。其中，LAB发酵作为一种绿色温和的生物修饰技术备受关注。尽管有研究表明特定LAB菌株能降解WPI或SPI的抗原表位，但关于LAB发酵对WPI-SPI双蛋白体系的水解及致敏性降低的研究仍然匮乏。此外，LAB在基因组水平上通过蛋白酶介导脱敏的机制尚未阐明。基于此背景，研究人员旨在筛选出能有效降低WPI-SPI双蛋白体系致敏性的LAB菌株，并通过全基因组测序揭示其蛋白水解相关的遗传特征及潜在脱敏机制，同时评估其安全性。研究最终选定了一株具有显著降敏效果的菌株，为开发低致敏性双蛋白产品提供了候选菌株和宝贵数据。该论文发表在《Foods》期刊上。

研究人员将WPI和SPI按1:1混合配制双蛋白溶液，接种13株LAB进行发酵。通过测定pH、活菌数、蛋白酶活性、水解度（DH）、肽浓度、游离氨基酸释放量、SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE电泳分析、间接ELISA（酶联免疫吸附测定）测定抗原性及IgE结合抑制率等指标筛选目标菌株。随后，利用Illumina HiSeq和PacBio平台对选定的L. paracasei JM053菌株进行全基因组测序，并结合多个数据库进行生物信息学功能注释。样本队列来源包括6名对牛奶和大豆过敏患者的血清样本。

3.1.1. pH和活菌数：通过测定发酵48小时后的样品，发现所有发酵液pH显著下降，活菌数有所降低。L. paracasei JM053在pH 3.77下保持了7.4 × 10⁶ CFU/mL的较高活菌数。
3.1.2. 蛋白酶活性：通过测定培养上清液中的蛋白酶活性，发现L. paracasei JM053表现出最高的蛋白酶活性（54.01 U/mL）。
3.1.3. DH：通过OPA法测定，发现所有菌株发酵后的DH均显著增加，其中L. paracasei JM053的水解率最高，达30.50%。
3.1.4. 肽浓度和游离氨基酸：通过BCA法和氨基酸分析仪测定，发现L. paracasei JM053发酵液具有最高的总游离氨基酸（FAA）含量和最高的总必需氨基酸（EAA）含量。同时，其释放的与WPI和SPI致敏表位相关的FAA水平最高，表明其具有最强的蛋白水解和肽酶活性。
3.1.5. 电泳：通过SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE分析，发现L. paracasei JM053发酵导致高分子量蛋白广泛降解且无中间条带积累，α-La条带显著减少，低分子量条带更丰富，表明蛋白质被更彻底地水解为小肽。
3.1.6. 抗原性：通过间接ELISA测定，发现L. paracasei JM053发酵后7S、11S、β-Lg和α-La四种过敏原蛋白的抗原性均降至最低。
3.1.7. IgE结合抑制率：通过使用过敏患者血清的间接ELISA测定，发现L. paracasei JM053发酵后的IgE结合抑制率最高，达48.75%。
3.2.1. 抗生素敏感性：通过测定最低抑菌浓度（MIC），发现L. paracasei JM053对所有测试抗生素的MIC值均低于EFSA推荐的截止值，无表型耐药性。
3.2.2. 溶血活性：通过血琼脂平板培养，发现L. paracasei JM053表现为γ-溶血（无溶血活性），符合益生菌安全标准。
3.2.3. 吲哚检测：通过吲哚试验，发现L. paracasei JM053不产生色氨酸酶，结果为阴性。
3.2.4. 硝酸还原酶活性：通过硝酸盐还原试验，发现L. paracasei JM053无硝酸还原酶活性。
3.2.5. 氨基酸脱羧酶活性：通过氨基酸脱羧酶试验，发现L. paracasei JM053不产生生物胺，结果为阴性，证明其具有良好的安全性。
3.3.1. 一般基因组特征：通过全基因组测序和构建系统发育树，证实L. paracasei JM053含有一条3,136,444 bp的环状染色体和一个3096 bp的质粒，且与Lacticaseibacillus paracasei亲缘关系最近。
3.3.2. 编码基因预测和功能注释：通过多数据库注释，发现L. paracasei JM053富含碳水化合物利用、细胞包膜成分和肽代谢相关基因，表明其具有粘附和蛋白水解的遗传倾向。
3.4.1. 蛋白水解相关基因分析：通过基因组注释发现，L. paracasei JM053拥有完整的蛋白水解系统，包括细胞包膜蛋白酶和脯氨酸特异性肽酶。通过生物信息学预测，β-Lg片段AA41-60和7S α亚基片段AA51-76可被该酶系完全水解为短于五个残基的肽或游离氨基酸，从而破坏线性表位，降低致敏性。
3.4.2. 碳水化合物代谢相关基因分析：通过CAZy数据库注释和代谢途径预测，发现L. paracasei JM053具备蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖代谢的完整遗传库，具有强大的碳源利用潜力。
3.5. 次级代谢产物的生物合成基因簇：通过antiSMASH分析，发现L. paracasei JM053含有两个预测的细菌素基因簇，表明其具有产生细菌素的遗传基础。
3.6. 毒力因子和抗生素抗性基因：通过VFDB和CARD数据库分析，发现L. paracasei JM053的毒力因子基因主要与基本代谢相关，无侵袭性特征；且不存在符合EFSA标准的抗生素抗性决定簇，基因型安全评估与表型结果一致。
3.7. 益生菌相关基因分析：通过基因组预测，发现L. paracasei JM053拥有大量应激反应基因，表明其具有应对各种环境胁迫的遗传潜力。

在本研究中，L. paracasei JM053被鉴定为一种有前景的发酵菌株，具有降低WPI-SPI双蛋白体系体外致敏性的潜力。在评估的13株LAB菌株中，JM053表现出优越的蛋白水解性能和高IgE结合抑制率。全基因组分析显示，JM053拥有全面的蛋白水解系统，包括PrtP、肽转运蛋白（OppABCDF和DppABCDE）以及多种细胞内肽酶，为其蛋白降解能力提供了基因组证据。此外，体外安全性评估和基因组分析支持其具有良好的安全特性和益生菌潜力。总体而言，本研究为开发低致敏性双蛋白产品提供了一个有前景的候选菌株，并为LAB介导的蛋白水解在降低致敏性中的潜在作用提供了初步见解。需要注意，本研究旨在筛选具有降敏能力的LAB菌株，而非阐明发酵动力学。当前基于48小时发酵终点设计，蛋白水解与致敏性降低的动态关系需进一步研究。未包括酸化非发酵对照和热灭活细胞对照，限制了对酸化和细胞相关因素贡献的区分。未来需纳入时间进程采样和额外对照，以进一步阐明LAB介导降低致敏性的机制。