环境预调节塑造本土放线菌促植物生长性状的表达及制剂后稳定性

《Polymers》：Environmental Preconditioning Shapes the Expression and Post-Formulation Stability of Plant Growth-Promoting Traits in Native Actinobacteria

　　

土壤放线菌中促植物生长（PGP）性状的功能表达受非生物因素制约，但pH和温度对其代谢谱的共同影响，以及这些代谢谱在包埋制剂和加工后压力下的稳定性仍缺乏充分表征。本研究旨在评估本土放线菌的生理可塑性及其在不同pH和温度条件下促植物生长（PGP）性状的表达，以及包埋、脱水和暴露于紫外线（UV）照射后的稳定性。研究人员分析了从半干旱农业土壤中分离的菌株，以确定其产生吲哚-3-乙酸（IAA）、铁载体和磷酸酶的能力，以及固氮、降解纤维素和耐受盐胁迫的能力。温度和pH显著影响所有评估的PGP性状（p < 0.001），且其表达与生物量产生无直接关联。两株菌S1和S4表现出最高的总体PGP指数。菌株S1在中性条件（pH 7.0，30 °C）下使IAA和铁载体产量最大化，而菌株S4在测试的pH和温度范围内保持更稳定的磷酸酶活性。包埋和脱水后细胞存活率保持在85%以上。脱水增强了菌株S1的IAA和铁载体产量，而菌株S4在未脱水胶囊中经紫外线照射表现出短暂的代谢激活。包埋基质对细胞存活率的保护比对完整PGP功能谱的保护更有效，表明单独的存活率不足以作为评估基于海藻酸盐的生物接种剂制剂技术成功与否的标准。这些发现强调了将环境预调节和功能稳定性评估整合到适应环境条件波动的农业系统的稳健微生物接种剂开发中的重要性。

自20世纪60年代以来，无机肥料和农药的过度使用导致土壤退化、养分流失、地下水污染和全球生态系统恶化。在墨西哥，这些做法引发了对长期粮食安全和环境污染的担忧。促植物生长微生物（PGP-Ms）作为减少对合成肥料依赖的可持续替代品，通过直接和间接机制促进植物发育。放线菌因其广泛的代谢多样性、在农业土壤中的分布以及合成农艺生物活性化合物的能力而备受关注。然而，放线菌代谢物的产生受土壤pH和温度等环境因素影响。尽管已有研究关注这些因素对PGP性状的影响，但较少有研究采用析因设计评估其交互效应，且海藻酸盐包埋对干燥和紫外线（UV）暴露后代谢功能的维持影响尚不明确。因此，研究人员开展了一项研究，旨在确定pH和温度对本土放线菌生理可塑性及PGP性状表达的影响，并评估海藻酸钙包埋对干燥和UV暴露后细胞存活率及代谢功能的保护作用。该研究得出结论，pH和温度是PGP性状表达的关键调节因子，且细胞存活率与功能表现并不是包埋后的等效结果。本论文发表在《Polymers》期刊，对开发适应环境波动的农业系统的稳健微生物生物制剂具有重要意义。

样本队列来源于墨西哥Nextlalpan的半干旱农业土壤。采用完全析因实验设计，评估6株放线菌（S1-S6）在3个pH（5.5, 7.0, 8.5）和3个温度（25, 30, 37 °C）下的生理表现。通过形态学观察、定量和定性分析确定PGP能力（产IAA、铁载体、磷酸酶、固氮、纤维素降解、耐盐）。基于促植物生长全局指数（PGP-GI）筛选出S1和S4菌株进行海藻酸钙包埋、脱水及365 nm UV-A照射处理，检测其细胞存活率和代谢活性。

3.1. 微生物在固体和液体培养基中的生长：通过在Czapek和ISP3培养基上培养，发现pH显著影响菌落大小、形态及色素产生，菌丝形态和细胞聚集稳定性受pH调节。
3.2. 生物量产生：通过方差分析（ANOVA）发现温度、pH及两者的交互作用显著影响生物量。37 °C和pH 5.5下生物量最高，但均低于对照菌株Streptomyces lydicus。
3.3. 促植物生长活性的定性分析：
3.3.1. 菌株在无氮培养基中的生长：通过非参数检验发现生长受菌株和温度显著影响，25–30 °C适合生长，37 °C显著抑制。
3.3.2. 磷酸盐溶解：通过Pikovskaya培养基分析，S4和S. lydicus表现出低至中等的磷酸盐溶解指数（PSI），温度显著影响PSI。
3.3.3. 纤维素分解活性：通过羧甲基纤维素（CMC）固体培养基分析，发现纤维素分解活性受温度显著影响，30 °C活性最高，25 °C几乎检测不到。
3.3.4. 几丁质分解活性：在含胶体几丁质的培养基上未检测到降解晕，但菌落生长受菌株和温度显著影响。
3.4. 促植物生长代谢物：
3.4.1. 吲哚-3-乙酸（IAA）：通过广义线性模型（GLM）分析，IAA产量受温度、pH、菌株及交互作用显著影响。S1产量最高，比对照高100-300%。
3.4.2. 铁载体：铁载体产量同样受温度、pH、菌株及交互作用显著影响，升高温度和pH增加产量，S1平均产量最高（38.6 μg mL^-1）。
3.4.3. 碱性和酸性磷酸酶活性：这两种酶活性受温度、pH、菌株及温度×pH交互作用显著影响。温度从25 °C升至30 °C，酶活性显著增加，37 °C受抑制；随pH升高活性增加。S2、S3和S4产量最高。
3.4.4. 铵生成：铵产量较低（<0.025 U mg^-1蛋白），但温度、pH、菌株及交互作用影响显著。温度是主要决定因素，37 °C和pH 7.0–8.5活性最高。
3.4.5. 耐盐性：菌株、盐度及交互作用显著影响生长。NaCl从2.5增至7.5 g L^-1时，S1、S2和S4生长减少，而S5和S6生长改善。
3.5. 菌株促植物生长功能谱：计算PGP-GI发现S4（84.1%）和S1（83.6%）指数最高，其PGP代谢物产生主要在30 °C和pH 7.0–8.5时最佳。
3.6. 菌株S1和S4在海藻酸盐脱水基质中的固定化：通过挤压法包埋并脱水，存活率损失2%–12%，平均最终存活率为87 ± 3%。胶囊外观因pH不同呈现不同颜色。
3.7. 菌株S1和S4对365 nm紫外线照射的耐受性：通过非参数检验发现照射时间显著影响细胞存活率。脱水胶囊存活率（55–67%）显著高于湿润胶囊（约7%）。S1比S4更耐UV。
3.8. 包埋后代谢活性：S1在脱水后IAA和铁载体产量增加，但UV照射降低磷酸酶活性及释放的生物量；S4在湿润胶囊中受UV照射时铁载体和酸性磷酸酶活性短暂增加，但脱水显著降低其代谢性能。包埋前生理表现不能直接预测包埋后功能。

讨论部分指出，生物量产生受温度和pH交互影响。PGP性状表达高度依赖环境条件，表现出明显的功能可塑性。铁载体在碱性pH下产量增加与铁溶解度降低相符。S1和S4在PGP-GI中得分最高，但包埋和加工后的表现证明该指数不能直接预测技术稳定性。海藻酸钙包埋能有效保护细胞存活，但对PGP功能的保护不如对存活率的保护。脱水可能通过代谢物浓缩或应激反应改变代谢产物回收。UV照射在湿润胶囊中显著降低存活率，脱水胶囊则保留了较高存活率。响应UV取决于培养期间获得的生理状态和制剂条件。研究结论表明，pH和温度是本土农业土壤放线菌PGP性状表达的关键调节因子，其响应具有高度特异性且独立于生物量产生。在所有定量PGP性状中观察到的显著菌株×pH×温度交互作用表明，在单一培养条件下无法可靠评估微生物候选物的功能潜力。此外，虽然菌株S1和S4取得了相似的PGP-GI值，但它们通过不同的功能策略实现，这凸显了在环境梯度上评估多种机制以准确识别稳健微生物接种剂的重要性。海藻酸钙包埋有效保持了细胞存活率，而随后的干燥和UV暴露则根据菌株不同对代谢功能产生差异影响。S1和S4的对比响应支持了这一假设：在不同pH和温度条件下的生理可塑性与制剂相关压力后维持PGP性状的能力相关。更广泛地说，这些结果表明细胞存活率和功能表现并不是海藻酸盐包埋的等效结果，这强调在旨在保留加工后促植物生长活性的制剂设计中，不仅要针对微生物菌株，还需对聚合物基质本身进行工程化和评估。总体而言，这些发现强调，将环境预调节和加工后功能稳定性纳入菌株选择方案，可能有助于为暴露于多变土壤和气候条件的农业系统开发更具弹性和有效性的微生物生物制剂。