综述：抗氧化剂之间的相互作用：体外研究对于理解复杂系统中抗氧化剂作用的有用性如何？

《International Journal of Molecular Sciences》：Interactions Between Antioxidants: How Useful Are In Vitro Studies for Understanding the Action of Antioxidants in Complex Systems?

　　

抗氧化剂之间的相互作用被认为对适当的营养和健康益处至关重要。本综述讨论了体外（in vitro）抗氧化剂相互作用的各种类型、机制及其对测定条件的依赖性，并评估了从无细胞测定（cell-free assays）和细胞抗氧化活性测定（cellular antioxidant activity assays）获得的结果外推到体内（in vivo）和食品体系的有效性。体外研究表明，相互作用的类型（加和性（additive）、拮抗性（antagonistic）或协同性（synergistic））不仅取决于化合物的身份，还取决于它们的绝对浓度、浓度比、测定类型、反应介质和结果分析方法。此外，在简单模型系统中使用合成指示剂的抗氧化剂反应并不能完全反映它们在食品体系和生物体中的反应性。尽管体外研究可能是解释抗氧化剂之间相互作用机制的有用且必要的步骤，但它们对于解释体内观察到的现象的重要性似乎有限，因为被称为抗氧化剂的化合物的机体效应更多地取决于它们对特定信号通路的作用，而不是它们的直接抗氧化作用。然而，它们可能为食品防腐提供有用信息，允许减少抗氧化剂添加剂的用量。

1. 引言
在近几十年中，抗氧化剂在生物医学和食品科学中引起了广泛兴趣，部分源于自由基衰老理论的普及、地中海饮食的益处以及许多疾病中氧化应激的发生。在食品科学中，加工食品的日益使用增加了对安全天然抗氧化剂的需求。对单个抗氧化剂的研究已阐明其在不同水平的作用机制，但生物体和食品中抗氧化剂并非单独存在，而是与其他抗氧化剂、代谢物、蛋白质、脂质等共存，因此抗氧化剂之间的相互作用成为理解其在复杂系统中作用的关键。零假设认为多个抗氧化剂的联合效应等于各单独效应之和（加和性），但实际中可能观察到协同或拮抗作用。通常，食用完整水果或蔬菜比单独补充剂更有益，这归因于全食物中植物化学物质的相互作用。抗氧化剂相互作用在食品和其他易氧化系统中具有实际意义，协同作用可减少防止氧化所需的抗氧化剂添加量。由于体内相互作用研究困难，主要依赖体外模型系统，但能否将结果外推到体内或复杂食品产品尚需评估，这正是本综述的目的。

2. 相互作用类型的评估
抗氧化剂之间相互作用的类型通过比较单一抗氧化剂及其混合物的测定参数（如指示剂还原程度、反应滞后时间等）来评估。常用方法包括直接求和法，即比较混合物效应与各组分单独效应之和，但要求抗氧化剂剂量与效应呈严格线性关系，这在许多测定中不成立。Chou-Talalay方法基于中效方程，通过计算联合指数（CI）判断相互作用：CI<1为协同，CI=1为加和，CI>1为拮抗。该方法需至少10个数据点，且剂量-反应曲线的非线性可能导致错误结论。Webb方法适用于酶抑制模型，通过公式计算预期加和效应。所有方法的局限性在于实验数据与公式的精确匹配，以及区分加和与非加和效应的困难，通常使用10%或5%差异作为任意阈值，但缺乏统计显著性。统计分析虽被推荐，但测量精度可能成为分类的决定性因素，小的统计显著偏差不一定代表化学或生物学上有意义的协同。

3. 相互作用类型取决于许多变量
最常见的抗氧化剂相互作用研究测定方法包括ABTS^•脱色、DPPH^•脱色、氧自由基吸收能力（ORAC）、铁还原抗氧化能力（FRAP）等，其机制、条件和生理相关性各异。已有大量综述报道二元混合物中的协同、拮抗和加和相互作用，本文仅展示代表性结果。一些ORAC组合中报道的异常高协同效应令人惊讶，可能源于测定非线性，因为ORAC仅在特定浓度范围内线性。

3.1 相互作用类型取决于测定方法
相同的化合物混合物在不同测定中可能显示不同相互作用类型。例如，抗坏血酸、绿原酸和半胱氨酸的混合物在超氧阴离子清除中呈加和，在羟自由基清除中呈拮抗，在叔丁基过氧自由基清除中呈协同。姜黄素与表儿茶素或绿茶表儿茶素组分的相互作用在ABTS^•脱色中呈协同，但在脂质过氧化抑制中呈拮抗。不同测定机制不同，但即使同一机制（如SPLET）的两种测定也可能得出不同结论。即使在同一方法内，预测加和效应的方法不同也会导致分类差异。例如，黄酮类与谷胱甘肽的研究中，传统分析法显示弱拮抗，而Webb模拟显示弱协同。此外，ABTS^•脱色与另一种ABTS法（测量滞后时间）的结果也不同。因此，建议使用多种方法评估抗氧化剂相互作用。

3.2 相互作用类型取决于相互作用化合物的身份
即使在同一类化合物中，相互作用类型也随具体化合物变化。例如，在DPPH^•脱色中，没食子酸与原儿茶酸、没食子酸与绿原酸、原儿茶酸与绿原酸的等摩尔混合物显示协同，而没食子酸与香草酸显示拮抗。在ORAC中，两种羟基苯甲酸的组合主要为协同，但范围从70%到336%不等；三种羟基苯甲酸主要为拮抗；四种则混合。羟基肉桂酸组合中，二元主要为协同，三元主要为拮抗，四元混合。在ABTS^•脱色中，所选酚类化合物（儿茶素、绿原酸、花青素等）之间仅观察到加和效应，尽管有些偏离加和但不显著。基于g-C₃N₄/NiS/TiO₂传感器的光电化学电极显示多种二元和复杂混合物呈协同，但原花青素/没食子酸为拮抗。儿茶素显著降低锦葵色素-3-葡萄糖苷和芍药色素-3-葡萄糖苷的脱色速率，但对其他花青素影响较小。在亚油酸氧化异味形成研究中，相互作用类型取决于所分析的醛类产物。

3.3 相互作用类型取决于绝对浓度和浓度比
羟基苯甲酸在FRAP中，3.2 μM浓度时含龙胆酸的所有混合物呈协同，但随浓度升高协同减弱甚至消失。三元混合物中，原儿茶酸+龙胆酸+丁香酸在3.2 μM下协同最强（274%），但浓度升高后下降。羟基肉桂酸的三元组合大多为拮抗，仅少数例外。黄酮类二元系统在FRAP中，儿茶素+槲皮素和儿茶素+槲皮素-3-β-葡萄糖苷的协同效应随儿茶素比例降低而增加。在DPPH^•脱色中，槲皮素与白藜芦醇在摩尔比1:1、2:1、3:1时协同，但在1:2和1:3时拮抗；氢醌与山奈酚在1:3至3:1范围内协同，最大效应在2:1；芦丁与白藜芦醇的协同效应随芦丁比例增加而增强。海藻糖与抗坏血酸等的相互作用呈拮抗，且随浓度降低而减弱。二元抗氧化剂配方（TBHQ:BHA等）在特定重量比下显示最佳协同效应。

3.4 相互作用类型取决于反应介质
反应介质如粘度、pH、极性影响抗氧化剂电离状态、溶解度、相分配和氧化还原电位，从而改变相互作用。例如，α-生育酚和γ-谷维素在米糠油中主要拮抗，但在精炼椰子油中协同。白藜芦醇与生育酚类似物PMHC在Triton X-100和SDS胶束中加和，在CTAB胶束和脂质体系统中协同，且pH依赖。这些依赖性表明，体外实验结果外推到体内或食品系统时需考虑介质因素。

4. 抗氧化剂之间的相互作用机制
提出了几种机制解释非加和性，首先是抗氧化剂再生。

4.1 抗氧化剂的再生
在还原指示剂自由基的测定中，抗氧化剂A与自由基反应生成A^•，后者可被另一抗氧化剂B还原再生A，同时生成B^•。经典例子是抗坏血酸再生生育酚自由基，该过程热力学可行。在膜系统中，α-生育酚位于界面，其自由基与水溶性抗坏血酸反应再生。其他化合物如泛醇、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等也能再生生育酚。在α-生育酚+绿茶儿茶素+抗坏血酸系统中，协同作用归因于抗坏血酸再生儿茶素自由基，进而再生生育酚。γ-萜品烯与PMHC或CAPE的协同归因于γ-萜品烯再生链阻断抗氧化剂自由基。TBHQ与焦棓酚的协同通过再生焦棓酚实现。β-胡萝卜素与虾青素或番茄红素与虾青素的协同归因于虾青素在界面被更还原的类胡萝卜素再生。单纯的再生不改变自由基总量，但可通过以下机制产生协同：(i) B与指示剂反应慢，但能再生A；(ii) A^•对指示剂反应性低，再生后提高活性。然而，在长时间连续自由基流中，慢反应也有机会进行，因此体外协同可能是实验假象。

4.2 反应机制的改变
γ-萜品烯通过将链增长自由基从ROO^•转变为HOO^•，后者自终止和交叉终止更快，从而提高整体终止效率，解释其协同效应。

4.3 抗氧化剂异源二聚体和同源二聚体及其他反应产物的形成
抗氧化剂自由基可发生重组，形成二聚体或更高氧化产物。若形成的共轭物反应性低于GSSG，则导致拮抗；若反应性更高，则导致协同。例如，TBHQ与焦棓酚形成异源二聚体，具有更强抗氧化活性。黄酮类中，具有邻二酚结构的与谷胱甘肽显示协同，因醌型产物与谷胱甘肽形成加合物。白藜芦醇自由基在脂质过氧化中形成二聚体和环化产物，保留羟基基团，增强活性。TBHQ氧化产生的苯并呋喃衍生物也具强抗氧化活性。褪黑素氧化产物形成“自由基清除级联”。糖类与多酚的缩合反应可能降低或增加活性。

4.4 抗氧化剂之间的非共价相互作用
分子间氢键形成可能降低抗氧化活性。没食子酸与原花青素之间的拮抗归因于羧基和酚羟基间的氢键结合。黄酮类之间的氢键可减少-OH基团可利用性，从而降低活性。

4.5 金属螯合
许多抗氧化剂（如黄酮类）能螯合金属离子，影响其催化氧化反应或自身抗氧化活性。金属结合可能降低或增加抗氧化剂的内在活性，从而影响混合物的加和性。例如，黄酮类金属配合物在DPPH^•脱色中活性更高。但FRAP中Fe(III)过量，螯合影响较小。

5. 抗氧化剂与蛋白质的相互作用
抗氧化剂可与食品或血浆蛋白形成非共价复合物或共价结合，影响抗氧化反应性。结合通常增强蛋白质的抗氧化活性，但降低小分子抗氧化剂的活性，但存在例外。EGCG和咖啡酸与乳清蛋白的相互作用同时显示协同和拮抗，前者归因于蛋白质构象变化暴露亲核位点，后者归因于氢键形成减少羟基基团。蛋白质-酚类复合物的消化可释放抗氧化剂。水稻蛋白与酚酸的复合物增加蛋白质活性但降低消化率。绿原酸与小麦蛋白和酪蛋白在模拟消化后显示协同。

6. 福林-酚试剂测定中抗氧化剂之间的相互作用
福林-酚（Folin-Ciocalteu）试剂测定总酚是基于氧化还原反应。在香料提取物与合成抗氧化剂组合中观察到加和，但某些情况下有协同。豆类/非豆类/水果食品组合中多为拮抗。绿茶、蜂蜜和柠檬提取物混合物显示协同（144.0-181.3%）。螺旋藻与苹果汁或日本木瓜汁的混合中，测得酚类含量仅为各组分之和的77%和74%，质疑该测定结果的真实性。

7. 复杂食品产品中的抗氧化剂相互作用
食品产品之间的相互作用研究众多，机制更难以评估。绿茶与蜂蜜和柠檬提取物在ABTS^•脱色中协同；甘薯提取物、茶多酚和葛根黄酮在DPPH^•脱色和FRAP中协同；红瓜叶和艾纳香提取物在ABTS^•中取决于比例，在DPPH^•中多协同；芒果叶和大飞扬草乙醇提取物在FRAP中取决于比例；TC-16多草药配方与蜂蜜在ABTS^•、DPPH^•和FRAP中拮抗，在ORAC和β-胡萝卜素漂白中协同；牧豆树和阿拉伯胶树等甲醇提取物在DPPH^•中强协同；螺旋藻与苹果汁在FRAP中加和，在ABTS^•中拮抗，与日本木瓜汁在FRAP中协同，在ABTS^•中加和，且与生物可利用部分有差异；月桂、西班牙薰衣草和薄荷精油多协同，但取决于比例和测定方法；苦橙皮与两种蒿属植物提取物在ABTS^•和FRAP中多协同。QUENCHER法分析显示不同食品产品间存在拮抗、加和和协同，且模拟消化后类型常变化，部分拮抗归因于多酚与牛奶蛋白结合。基于协同分析，Liu等认为七叶亭和龙胆酸可能是增强茶籽油氧化稳定性的主要酚类。

8. 细胞抗氧化活性
细胞抗氧化活性测定基于细胞内荧光探针的氧化抑制，比无细胞测定更接近体内情况，但存在局限性：细胞内抗氧化剂和酶贡献ROS清除，抗氧化剂转运和代谢影响实际浓度，且不同细胞类型结果不同。在大鼠心肌细胞H9c2中，飞燕草素与番茄红素、绿原酸与叶黄素等组合的相互作用取决于浓度比。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、Caco-2和L-02细胞中，叶黄素与槲皮素、叶黄素与木犀草素、番茄红素与槲皮素、番茄红素与木犀草素的相互作用呈细胞系依赖性，归于类胡萝卜素对膜转运蛋白表达的影响。

9. 讨论
体外研究被认为是阐明抗氧化剂相互作用机制的必要初始步骤，但结果应谨慎解释。大多数测定条件（溶剂、pH、温度、缺乏天然基质等）与生理条件不同，时间框架有限，且合成指示剂自由基与生物相关底物保护不直接相关。细胞活性测定中使用的抗氧化剂浓度通常远高于体内暴露水平，且实际细胞内浓度未知。主要问题在于这些研究对化合物机体效应的相关性：内源性抗氧化剂和维生素与酶合作，体外未包含酶促再生。外源性植物源性抗氧化剂（如酚类）是次生代谢物，生理效应复杂，直接抗氧化作用仅其一。它们通常被微量吸收，不能显著影响人体氧化还原平衡，且经受代谢转化。代谢产物与母体化合物具有不同生物学性质。然而，它们可局部积累，影响细胞和组织氧化还原信号。例如，黄烷醇和原花青素通过结合NADPH氧化酶抑制超氧化物产生，或通过干扰NF-κB、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信号通路发挥作用。在生物膜中，黄酮类干扰脂筏结构，影响膜信号。EGCG影响脂筏，阻断c-Met受体活化。这些效应可能独立于抗氧化活性，但通过激活Keap1-Nrf2等通路介导抗氧化效应，这些效应无法被体外测定检测。

10. 结论与展望
综上所述，体外抗氧化剂相互作用研究对理解体内效应的重要性有限。然而，对食品防腐有用，可直接应用于实践，减少抗氧化剂添加量。但模型系统中的相互作用需在实际食品基质和加工储存条件下验证。未来研究应包含多浓度和比例分析、浓度-反应依赖、动力学分析、精心选择加和模型、机制不同的测定和适当统计，并旨在阐明分子机制，结合抗氧化测定与分析技术鉴定中间体和产物，使用与生理或食品系统相关的底物和条件，最终在相关食品或生物系统中验证。理解抗氧化剂反应的真实过程应能解释和预测相互作用，包括体内作用。