与植入结局相关的基质衰老与子宫内膜微生物群之间的关联

《Microorganisms》：Implantation Outcome-Specific Associations Between Stromal Senescence and the Endometrial Microbiota

　　

子宫内膜衰老和子宫内膜微生物群均被认为参与子宫内膜容受性的调控，然而它们之间的关系仍不清楚。本研究旨在探讨p16（p16^INK4a）阳性子宫内膜细胞与植入窗口期微生物群组成之间的关联，并确定这些关系是否因植入结局而异。研究人员通过p16免疫组化和数字图像分析评估子宫内膜衰老，同时通过16S rRNA基因测序（16S rRNA gene sequencing）对68名女性在单倍体胚胎移植前采集的子宫内膜活检样本进行微生物群组成分析，活检后六个月内采用相同的激素准备方案进行胚胎移植。根据随后的植入结局，未观察到腔上皮或基质p16丰度的显著差异。尽管衰老与植入成功无直接关联，但基质p16表达与子宫内膜微生物群表现出多种关联。基质p16阳性率增加与乳酸杆菌（Lactobacillus）相对丰度降低和代尔夫特菌（Delftia）丰度升高相关。值得注意的是，在探索性亚组分析中，成功妊娠的女性中观察到更显著的关联，包括基质p16表达与乳酸杆菌丰度呈负相关（ρ = ?0.48，p = 0.005），与代尔夫特菌丰度呈正相关（ρ = 0.42，p = 0.016）。物种水平分析揭示了与植入结局相关的特定关联，涉及惰性乳酸杆菌（Lactobacillus iners）和阴道乳杆菌（Limosilactobacillus vaginalis）。此外，基质p16表达与微生物共现网络的差异相关，表明对微生物群落组织有更广泛的影响。总之，这些发现表明，在植入窗口期，基质（而非腔上皮）衰老与子宫内膜微生物群组成和微生物群落组织密切相关。最强的衰老-微生物群关联出现在随后成功植入的女性中，这一观察结果支持了以下假设：协调的衰老-微生物群关系可能是容受性子宫内膜微环境中一个以前未被充分认识的特征。

子宫内膜衰老与微生物群在植入窗口期的关联：一项前瞻性队列研究解读

**研究背景与问题**

子宫内膜容受性是胚胎成功植入的关键，受激素信号、免疫细胞活动、组织重塑及局部炎症反应等多因素调控。近年来，细胞衰老（cellular senescence）和子宫内膜微生物群（endometrial microbiota）均被独立证实与生殖结局相关。细胞衰老以稳定细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（SASP）为特征，其在子宫内膜中表现为生理性、短暂的过程，参与蜕膜化和植入窗口期组织重塑；然而，异常或持续性衰老可能损害子宫内膜容受性，导致生殖障碍。同时，16S rRNA基因测序（16S rRNA gene sequencing）揭示子宫内膜存在独特的微生物群落，乳酸杆菌（Lactobacillus）的主导地位常与良好妊娠结局相关，而微生物多样性增加则提示菌群失调。尽管两类生物学过程均影响子宫内膜功能，但两者之间的相互作用机制尚不清楚。现有研究缺乏对基质衰老（stromal senescence）与微生物群在植入窗口期关联的系统性探讨，尤其是不明确这些关系是否因植入结局而异。因此，本研究旨在分析p16^INK4a（p16）阳性基质细胞与微生物群组成之间的关联，并评估其与单倍体胚胎移植后植入结局的相关性。

**研究人员开展的研究与结论**

研究人员对68名接受单倍体胚胎移植的女性（来自保加利亚Nadezhda Women's Health Hospital），在激素替代治疗（HRT）周期植入窗口期（孕激素第5天）采集子宫内膜活检样本，进行前瞻性观察研究。通过p16免疫组化（IHC）和数字图像分析评估基质和腔上皮中的衰老细胞比例，并利用16S rRNA基因扩增子测序（V4-V5区）表征微生物群组成。分析发现，基质p16表达与植入成功无直接关联，但基质p16阳性率与乳酸杆菌相对丰度呈负相关，与代尔夫特菌（Delftia）丰度呈正相关，尤其在成功妊娠的女性中相关性更显著。物种水平分析显示惰性乳酸杆菌（Lactobacillus iners）和阴道乳杆菌（Limosilactobacillus vaginalis）与基质衰老存在植入结局特异性关联。此外，微生物共现网络分析表明，基质p16表达与微生物群落组织结构的改变相关。研究结论提示，基质（而非腔上皮）衰老与子宫内膜微生物群组成及群落组织在植入窗口期紧密关联，且协调的衰老-微生物群关系可能是容受性子宫内膜微环境的一个潜在特征，但两者因果关系尚需进一步验证。该论文发表在《Microorganisms》。

**主要关键的技术方法**

研究人员主要采用以下关键技术：1）p16免疫组化结合HALO数字图像分析，分别定量腔上皮和基质中p16阳性细胞比例；2）16S rRNA基因（V4-V5区）扩增子测序，通过QIIME2和DADA2流程进行序列处理，基于SILVA数据库（138.2版）进行物种分类；3）使用decontam基于流行率方法进行污染控制分析；4）Spearman秩相关分析评估基质p16与微生物属丰度的关联，并采用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正；5）微生物共现网络分析（基于Spearman相关，p<0.05定义边）用于比较低/高基质p16组的群落组织差异。样本队列来自68名接受单倍体胚胎移植的女性，活检与胚胎移植均在同一激素准备方案下进行。

**研究结果**

**3.1 患者特征**：研究纳入68名女性（32名妊娠，36名非妊娠），两组在年龄、BMI、生殖史、内膜厚度、活检与移植间隔及不孕诊断方面无显著差异（p>0.05）。

**3.2 p16阳性细胞与植入结局**：通过比较妊娠组与非妊娠组，腔上皮和基质p16阳性细胞比例均无显著差异（p=0.49和p=0.85），表明p16丰度与植入成功无直接关联。

**3.3 污染评估**：通过decontam基于流行率分析识别出14个候选污染ASV，分布于11个属，但主要关联的乳酸杆菌和代尔夫特菌无候选污染ASV，确保主要结果稳健。

**3.4 基质p16与微生物群的相关性**：对保留的6个属（乳酸杆菌、Cutibacterium、代尔夫特菌、葡萄球菌、Litchfieldia、Allobaculum）进行Spearman相关分析，发现基质p16阳性率与乳酸杆菌丰度呈负相关（ρ=-0.269，p=0.027），与代尔夫特菌丰度呈正相关（ρ=0.296，p=0.014），但FDR校正后未达显著（q=0.079）。腔上皮p16与各属无显著相关。

**3.5 按植入结局分层的相关性**：在妊娠组中，基质p16与乳酸杆菌呈显著负相关（ρ=-0.485，p=0.0049，q=0.0295），与代尔夫特菌呈显著正相关（ρ=0.421，p=0.0165，q=0.0494）；非妊娠组中无显著相关（乳酸杆菌ρ=-0.041，p=0.812；代尔夫特菌ρ=0.137，p=0.424）。表明这些关联在成功植入者中更突出。

**3.6 物种水平分析**：对三种最常见乳酸杆菌物种（惰性乳酸杆菌、阴道乳杆菌、詹氏乳杆菌）分析，发现妊娠组中基质p16与惰性乳酸杆菌呈负相关（ρ=-0.38，p=0.03），与阴道乳杆菌呈正相关趋势（ρ=0.32，p<0.10），詹氏乳杆菌无显著相关。提示物种特异性差异，且惰性乳酸杆菌与基质衰老的关联在妊娠组中达到统计学意义。

**3.7 根据基质p16表达分组的丰度差异**：以中位数0.63%为界，高基质p16组（>0.63%）乳酸杆菌丰度显著低于低基质p16组（p=0.015），代尔夫特菌丰度显著高于低基质p16组（p=0.049），与相关分析一致。

**3.8 微生物共现网络**：利用13个属（检测于≥10%样本）分别构建低和高基质p16组网络。高p16组网络边数稍多（24 vs 23），正相关比例更高（20/24 vs 17/23），网络密度（0.308 vs 0.295）和平均度（3.69 vs 3.54）略高，但低p16组聚类系数（0.485 vs 0.408）和平均交互强度（|ρ|=0.521 vs 0.429）更高。中心节点分析显示，低p16组Allobaculum和乳酸杆菌为中心，高p16组代尔夫特菌和Allobaculum为中心。表明基质p16与微生物群落组织结构改变相关。

**3.9 差异相关分析**：通过Fisher z变换比较妊娠组与非妊娠组相关系数差异，最大差异为乳酸杆菌（Δρ=-0.444），但FDR校正后均不显著。因此，尽管分层分析显示妊娠组内显著相关，但组间差异未达统计学意义。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次揭示基质p16阳性衰老细胞与子宫内膜微生物群组成（尤其是乳酸杆菌减少和代尔夫特菌增加）及群落组织（共现网络结构差异）的关联，这些关联在成功妊娠的女性中更为显著。研究人员认为，基质衰老细胞可能通过SASP（分泌促炎因子、基质重塑酶等）改变局部微环境，从而影响微生物生态；同时，微生物产物也可能通过慢性炎症和氧化应激诱导衰老，形成双向调节。然而，因果关系未定，存在样本量小、横断面设计、污染风险等局限性。研究结论翻译如下：本研究表明，在植入窗口期，基质（而非腔上皮）p16阳性衰老细胞与子宫内膜微生物群组成的特定改变相关。增加的基质p16阳性率与乳酸杆菌丰度降低和代尔夫特菌丰度升高相关，而物种水平分析显示涉及惰性乳酸杆菌和阴道乳杆菌的差异关联。重要的是，最强的衰老-微生物群关联出现在随后成功植入的女性中。尽管这些亚组特异性发现需在更大独立队列中验证，但它们提示协调的衰老-微生物群关系可能是容受性子宫内膜微环境中的一个以前未被充分认识的特征。此外，基质p16表达与微生物相互作用网络的差异相关，表明对微生物群落组织有更广泛的影响。总之，这些发现支持子宫内膜衰老和微生物群在植入窗口期是相互关联的生物过程这一概念。观察到的关联突出了细胞衰老、微生物群落结构和子宫内膜功能之间的潜在联系。需要进一步的前瞻性研究，包括预定义的较短活检到移植间隔和重复采样，以确定这些关系的方向性、时间稳定性和潜在临床相关性。