: 四种基于MEA的神经毒性筛查方法在Ni2+神经毒性评估中的应用比较

《Toxics》：A Comparison of the Application of Four MEA-Based Neurotoxicity Screening Methods in Ni2+ Neurotoxicity Assessment

　　

微电极阵列（MEA）技术被广泛应用于电生理研究，近年来在神经毒性筛查中的应用日益增多。在本研究中，研究人员通过MEA分析了不同浓度的Ni²⁺对大鼠脑切片新皮层区自发活动的平均放电和爆发率，以及电刺激诱发活动频率的影响，从而探究其神经毒性效应。结合研究团队先前关于Ni²⁺对诱发活动电刺激阈值影响的发现，研究人员比较了四种基于MEA的神经毒性筛查方法在Ni²⁺神经毒性研究中的应用效果。研究结果表明，所有这些方法都能有效评估Ni²⁺的神经毒性效应；然而，它们在某些方面存在差异，例如适用的神经元网络和数据处理方法。研究人员还发现，Ni²⁺通过不同的机制影响大鼠脑切片新皮层区的自发活动和电刺激诱发活动。

神经毒性是指化学物质对神经系统结构或功能产生的不良影响，主要关注与神经元和神经元网络电兴奋性直接相关的功能改变。常用的体外细胞毒性检测方法局限于检测细胞增殖、细胞形态和结构改变以及部分分子生物标志物，无法捕捉神经元及网络电兴奋性的变化，因此不能完全反映化学物质诱导的神经毒性。目前，大多数神经毒性作用只能通过耗时且耗费资源的体内动物实验来识别。因此，建立一种可靠的体外检测方法，能够监测神经元及网络电兴奋性的变化，并与传统方法结合，对早期药物开发中的神经毒性评估至关重要。微电极阵列（MEA，一种可实时检测多个神经元组成的神经元网络电生理活动的技术）克服了膜片钳等单细胞检测方法的局限，在电生理基础研究和化学物质神经毒性研究中得到广泛应用。目前基于MEA的神经毒性评估方法主要分为监测自发神经活动和评估诱发神经活动两大类。在自发活动分析中，平均放电率和平均爆发率是两个最基本的方法；在电刺激诱发活动分析中，通常关注刺激后短时间窗内诱发动作电位频率的特征，但其数据处理的复杂性限制了其在大规模筛查中的应用。为此，研究团队此前开发了一种通过分析诱发活动所需的电刺激阈值变化来评估化学物质影响的新方法。Ni²⁺是一种常见的电压门控Ca²⁺通道和NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸，一种兴奋性氨基酸受体）抑制剂，相关研究表明其能抑制神经元兴奋性并表现出神经毒性。在此背景下，研究人员利用MEA技术研究不同浓度Ni²⁺对大鼠脑切片新皮层区自发活动和电刺激诱发活动的影响，并结合团队前期关于Ni²⁺对诱发活动电刺激阈值影响的研究成果，比较评估了这四种基于MEA的神经毒性筛查方法在检测Ni²⁺神经毒性中的有效性。该研究论文发表在《Toxics》期刊上，其结果为未来该领域的研究提供了重要参考依据，且提出的新型阈值检测法在大规模神经毒性筛查中展现出重要意义和巨大潜力。

本研究的样本队列来源为30只SPF（无特定病原体）级SD大鼠（14日龄，雌雄混合，体重20-35克，购自上海实验动物研究中心）。主要关键技术方法包括：制备大鼠脑切片并置于MEA腔室中，记录新皮层区的电生理活动。在自发活动记录中，通过MATLAB工具包识别动作电位和爆发，分析平均放电和爆发率。在电刺激诱发活动频率分析中，施加固定强度电刺激，通过高斯核密度估计计算刺激周围放电率（PSFR，反映刺激前后放电频率变化的曲线），分析首个峰值的振幅和时间。在电刺激诱发活动阈值分析中，参考团队既往研究，施加递增强度的电刺激以确定能稳定诱发活动的最低电压阈值。

The Effect of Ni²⁺ on the Mean Firing and Bursting Rates of Spontaneous Activity in Neuronal Networks
研究人员通过测量平均放电率和平均爆发率这两种分析自发活动的方法评估了不同浓度Ni²⁺的神经毒性效应。结果显示，与对照组相比，暴露于50或100 μM的Ni²⁺显著降低了自发活动的平均放电和爆发率，表明网络兴奋性受到显著抑制。然而，在200或500 μM的Ni²⁺浓度下，这两个指标与对照组相比未检测到统计学上的显著差异。

The Effect of Ni²⁺ on the Frequency of Electrical-Stimulation-Evoked Activity in Neuronal Networks
在电刺激诱发活动频率分析中，研究人员比较了不同浓度Ni²⁺对刺激后50毫秒内PSFR曲线首个峰值振幅和时间的影响。结果表明，PSFR首个峰值的时间不受各浓度Ni²⁺显著影响，而该峰值的振幅随Ni²⁺浓度增加而逐渐降低。100、200或500 μM的Ni²⁺均显著降低了PSFR首个峰值的振幅，且其降低百分比呈增加趋势，表明Ni²⁺对电刺激诱发的神经元网络活动具有浓度依赖性的抑制作用。

The Effect of Ni²⁺ on the Electrical Stimulation Threshold of Evoked Activity in Neuronal Networks
基于研究团队前期的独立实验数据，研究人员分析了暴露于不同浓度Ni²⁺前后诱发活动的电刺激阈值变化。结果表明，与对照组相比，在50、100、200或500 μM的Ni²⁺作用下，记录电极的电刺激阈值中位数分别增加了14.3%、20%、36.7%和72.2%，表明Ni²⁺对神经元网络兴奋性的抑制作用随浓度增加而增强。

在讨论部分，研究人员首先对四种筛查方法进行了比较分析。基于自发活动的评估方法存在数据变异性大、依赖网络基线活动频率等局限性。相比之下，电刺激诱发活动分析具有更好的数据稳定性，其中经典的频率分析法需要手动确定最佳刺激强度，而本研究涉及的电刺激阈值检测法不仅数据稳定性优越，还无需在实验中手动调节刺激振幅，更适合未来大规模毒性筛查。然而，阈值检测法耗时较长，更适合体外培养的神经元网络。在数据复杂性方面，自发活动评估最简单，而电刺激诱发活动频率分析最为复杂。

在机制分析方面，研究人员观察到Ni²⁺对自发活动和诱发活动具有不同的抑制效应，这反映了不同的电生理特性。自发活动即使在突触传递被完全阻断时依然存在，且抑制性神经元对其频率有显著抑制作用。在本研究中，50或100 μM的Ni²⁺主要通过阻断T型Ca²⁺通道（一种低电压激活的钙通道）降低网络兴奋性，对抑制性神经元影响较小，从而导致自发活动下降。而200或500 μM的Ni²⁺不仅阻断NMDA受体，破坏兴奋抑制性神经元的信号传播，还通过阻断多种电压门控Ca²⁺通道损害抑制性神经元活动，导致突触抑制信号减少，使得自发活动部分恢复。此外，高剂量Ni²⁺显著降低了爆发中放电百分比，这一时序分布的分散进一步支持了高剂量Ni²⁺损害突触传递的假设。相比之下，电刺激诱发的活动主要源于直接被刺激激活的神经元及其连接，且以兴奋性突触连接为主。因此，诱发活动的变化主要受神经元兴奋性和兴奋性突触传递的影响，Ni²⁺对诱发活动的抑制作用随浓度增加而增强。然而，由于脑切片样本量较小且无法仅通过MEA数据可靠识别抑制性神经元，这些理论解释仍需通过特异性受体拮抗剂、膜片钳记录等手段进一步验证。

在结论部分，研究人员总结道，他们利用MEA探究了不同浓度Ni²⁺对大鼠脑切片新皮层区三个电生理参数的影响，并与此前的刺激阈值研究结果结合进行了比较分析。四种基于MEA的神经毒性筛查方法均对Ni²⁺诱导的神经毒性表现出敏感性。特别是研究人员提出的电刺激阈值检测法，在大规模神经毒性筛查中展现出巨大潜力。这项工作为基于MEA的神经毒性筛查技术的实际应用提供了有价值的见解。