《Nature and Science of Sleep》：Age-Associated Development of Sleep Disturbances in db/db Diabetic Mice
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摘要目的：睡眠的数量和质量紊乱与糖尿病相关，并已被认为是糖尿病发展的显著风险因素。然而，尚不清楚睡眠障碍是否在糖尿病进展过程中出现，以及可能涉及哪些潜在的神经生物学机制。研究人员旨在表征糖尿病db/db小鼠睡眠-觉醒表型的动态发展，并探讨相关的神经机制。方法：
摘要目的：睡眠的数量和质量紊乱与糖尿病相关，并已被认为是糖尿病发展的显著风险因素。然而，尚不清楚睡眠障碍是否在糖尿病进展过程中出现，以及可能涉及哪些潜在的神经生物学机制。研究人员旨在表征糖尿病db/db小鼠睡眠-觉醒表型的动态发展，并探讨相关的神经机制。方法：对2至6月龄糖尿病db/db小鼠进行多导睡眠图记录，以描述睡眠-觉醒特征的年龄依赖性变化。对脑组织进行转录组学分析，以研究与睡眠改变相关的潜在神经机制。结果：尽管db/db小鼠在2月龄时已出现高血糖，但非快速眼动睡眠（NREM）的显著碎片化始于3月龄。NREM睡眠的总量在光照期保持不变，但被持续时间≤8秒的微觉醒事件频率增加所打断。黑暗诱导的觉醒反应从3月龄开始逐渐下降，到6月龄时显著减弱。转录组学分析揭示，在3月龄时，皮层下脑区与睡眠-觉醒调节相关的基因出现显著失调。结论：这些结果表明，糖尿病通过影响皮层下脑区的睡眠-觉醒调节系统，导致睡眠碎片化和昼夜节律性受损。
论文解读文章
**研究背景与问题**
糖尿病是一种以持续高血糖为特征的慢性代谢紊乱，已成为全球日益严峻的公共卫生挑战。它与多种并发症密切相关，包括慢性肾病、缺血性心脏病和卒中。糖尿病还与神经系统功能障碍相关，如认知损害和记忆缺陷。尽管糖尿病可通过损伤细胞和脑血管影响神经系统，但其损伤的时间进程和潜在机制尚不明确。近年来，糖尿病与睡眠障碍之间的关系受到越来越多的关注。临床和流行病学研究表明，睡眠障碍（包括睡眠时长不足或过长、入睡困难以及睡眠质量受损）会加剧血糖控制异常，并与糖尿病发生风险增高相关。然而，尚不清楚睡眠障碍是否在糖尿病进展过程中出现，以及高血糖水平是否启动并加重了睡眠紊乱。此外，先前的研究主要关注单一时间点的睡眠障碍，缺乏对睡眠障碍动态发展的系统描述，尤其是4月龄之后的进展。同时，糖尿病与睡眠障碍之间的潜在分子联系在很大程度上仍未被探索。为此，研究人员开展本研究，旨在系统表征糖尿病db/db小鼠从2至6月龄的睡眠-觉醒表型动态变化，并通过转录组学分析揭示相关分子机制。
**研究内容与结论**
研究人员对2至6月龄的db/db小鼠和野生型（WT）小鼠进行了每月24小时的多导睡眠图记录，系统分析了睡眠-觉醒特征。此外，在2月龄和3月龄时，对皮层（含皮层和海马）和皮层下（含丘脑、纹状体、下丘脑、小脑和脑干）脑区进行了全转录组测序，以探索与糖尿病相关睡眠障碍相关的分子变化和信号通路。研究发现：db/db小鼠在2月龄时已出现高血糖，但非快速眼动睡眠（NREM）的显著碎片化始于3月龄，表现为NREM睡眠回合数增加、平均持续时间缩短，以及微觉醒事件（≤8秒）频率增加。黑暗期觉醒维持能力从3月龄开始受损，表现为觉醒回合数增加、平均持续时间缩短。黑暗诱导的觉醒反应随年龄增长逐渐减弱，至6月龄时显著减弱，表明昼夜节律性受损。转录组学分析显示，在睡眠碎片化出现的3月龄时，皮层下区域存在大量差异表达基因（DEGs），富集于神经活性配体-受体相互作用通路，涉及多巴胺D2受体（Drd2）、血清素受体Htr1d、胆囊收缩素B受体（Cckbr）、神经肽Y（Npy）等基因下调，以及精氨酸加压素（Avp）和催产素（Oxt）上调。这些发现表明，糖尿病主要通过影响皮层下睡眠-觉醒调节回路导致睡眠障碍。该研究发表在《Nature and Science of Sleep》，强调了将睡眠评估纳入糖尿病管理的重要性，并为代谢功能异常与睡眠调节之间的双向关系提供了新的机制见解。
**主要关键技术方法**
研究人员使用的主要技术方法包括：1）多导睡眠图记录：对db/db小鼠（BKS-Leprem2Cd479）和野生型（WT，C57BLKS/J）小鼠（均购自南京大学南京生物医药研究所）从2至6月龄进行每月24小时脑电图（EEG）和肌电图（EMG）记录，基于4秒epoch自动分类并手动校正睡眠分期。2）转录组测序与分析：在光照期固定时间点（ZT5）分离皮层和皮层下组织，提取总RNA，构建cDNA文库后进行Illumina NovaSeq 6000双端150bp测序，使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs）（|Log2FC|>1，校正P<0.05），并进行GO、KEGG通路富集分析和基因集富集分析（GSEA）。3）实时定量PCR验证：选取6个代表性DEGs进行qRT-PCR验证。
**研究结果**
**1. 糖尿病db/db小鼠从3月龄开始出现睡眠碎片化**
通过多导睡眠图记录，研究人员比较了db/db小鼠与WT小鼠在光照期（休眠期）的睡眠参数。结果显示，2月龄时两组NREM睡眠参数无显著差异；但3月龄起，db/db小鼠NREM睡眠回合数显著增加（P<0.01），平均持续时间显著缩短（P<0.01），表明NREM睡眠碎片化出现。这种碎片化在4至6月龄持续存在。进一步分析回合持续时间分布发现，3月龄db/db小鼠中短NREM睡眠回合（≤8s、8-16s、16-32s、32-64s）显著增多，长回合（>256s）显著减少，且微觉醒事件（≤8s的觉醒回合）频率显著增加。这些结果表明睡眠碎片化主要由微觉醒事件增加导致。
**2. 糖尿病db/db小鼠从3月龄开始黑暗期觉醒维持能力受损**
在黑暗期（活动期）的分析中，2月龄时db/db小鼠与WT小鼠的觉醒参数无显著差异；但3月龄起，db/db小鼠觉醒回合数显著增加，平均持续时间显著缩短（P<0.05），且这种变化在4至6月龄更为显著。同时，NREM睡眠回合数也增加，表明觉醒稳定性下降。至5和6月龄时，db/db小鼠在黑暗期出现NREM睡眠增加、觉醒减少，提示觉醒维持能力进行性恶化。
**3. db/db小鼠黑暗诱导的觉醒反应进行性减弱**
通过分析24小时睡眠-觉醒结构，研究人员发现，与2月龄相比，6月龄db/db小鼠在黑暗期初期（ZT12-16）觉醒减少、NREM睡眠增加。从3月龄开始，db/db小鼠在黑暗期前4小时（ZT12-16）的NREM睡眠总量显著高于WT小鼠，觉醒总量显著低于WT小鼠，反映黑暗效应减弱。在2至5月龄db/db小鼠中，黑暗能显著诱导觉醒增加（P<0.01），但在6月龄时该反应几乎消失（P=0.1520），表明黑暗诱导的觉醒反应随年龄下降，在6月龄时最明显。
**4. 3月龄db/db小鼠皮层下区域mRNA显著失调**
为探索年龄相关睡眠碎片化的神经分子机制，研究人员在2月龄和3月龄时分别采集db/db小鼠和WT小鼠的皮层（含皮层和海马）和皮层下（含丘脑、纹状体、下丘脑、小脑和脑干）脑组织进行转录组分析。在2月龄时，db/db小鼠皮层区域有13个上调、6个下调mRNA，皮层下区域有232个上调、260个下调mRNA，KEGG富集分析显示主要富集于神经活性配体-受体相互作用通路。在3月龄与2月龄的比较中，排除WT小鼠年龄相关变化后，db/db小鼠皮层区域仅发现6个上调和7个下调DEGs，而皮层下区域发现355个上调和55个下调DEGs。KEGG分析显示，上调mRNA富集于谷氨酸能突触、钙信号、长时程增强和昼夜节律夹带等通路；下调mRNA主要富集于神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号、瞬时受体电位（TRP）通道的炎症介质调节、5-羟色胺能突触、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号和多巴胺能突触等通路。代表性下调基因包括Drd2、Rasd2、Ankk1、Htr1d、Cckbr、Npy、Penk等，上调基因包括Grm1。qRT-PCR验证了Drd2、Cckbr、Npy、Htr1d、Penk表达显著下降，Grm1表达显著上升，与转录组结果一致。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，本研究揭示了db/db小鼠在2至3月龄之间出现睡眠和觉醒障碍，提供了睡眠障碍起病的时间证据。转录组分析发现多个与睡眠-觉醒调节相关的基因在皮层下区域差异表达，尤其是多巴胺D2受体（Drd2）信号通路的下调，可能与db/db小鼠异常觉醒和NREM睡眠调节有关。以往研究表明，表达DRD2的纹状体神经元促进睡眠，DRD2缺失小鼠在活动期出现NREM睡眠和觉醒碎片化，且腹腔注射DRD2激动剂普拉克索可部分恢复活动期NREM睡眠稳定性。此外，中脑腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能信号对黑暗诱导的觉醒至关重要，DRD2敲除小鼠在关灯后4小时内觉醒减少。因此，DRD2信号受损可能参与db/db小鼠睡眠异常。5-羟色胺能神经元在睡眠-觉醒调节中作用复杂，本研究中Htr1d表达下调可能与之相关。神经肽如胆囊收缩素（CCK）和神经肽Y（NPY）表达减少也提示睡眠调节异常。与高脂饮食诱导的肥胖小鼠不同，db/db小鼠的睡眠障碍可能涉及不同的病理生理机制。此外，db/db小鼠在2月龄时即出现REM睡眠减少，可能与瘦素信号缺失以及Avp、Oxt基因上调有关，而NREM睡眠碎片化在3月龄才出现，提示两种睡眠障碍由不同机制驱动。研究存在局限性：db/db模型小鼠在6月龄前有2只死亡，导致样本量减少；db/db模型同时存在瘦素受体缺失、肥胖和高血糖，无法区分各自贡献；转录组分析基于混合皮层下组织，无法精确定位到特定核团；每组3只小鼠的样本量虽符合标准但需更大样本验证。
**结论翻译**：在本研究中，研究人员对2至6月龄糖尿病db/db小鼠的睡眠结构进行了系统的纵向特征描述。研究发现，db/db小鼠在2月龄时早期出现REM睡眠减少，随后在3月龄时出现显著的NREM睡眠碎片化和觉醒不稳定性。NREM睡眠和觉醒障碍均随疾病进展逐渐加重。皮层下组织的转录组分析揭示了多个参与睡眠-觉醒调节的基因下调，包括Drd2、Htr1d、Cckbr和Npy，同时Avp和Oxt上调。这些分子变化与观察到的睡眠表型相关，为未来的机制研究提供了证据。总体而言，研究结果为睡眠障碍与糖尿病进展之间的潜在关联提供了证据，提示对糖尿病和睡眠障碍进行综合管理的重要性。
