机器学习增强的光热红外（O-PTIR）光谱技术用于快速同时识别多种代谢物以监测生物转化：基于啤酒糟（BSG）的概念验证

《Analytica Chimica Acta》：Machine-learning-enhanced Optical Photothermal infrared (O-PTIR) spectroscopy for rapid simultaneous identification of multiple metabolites to monitor biotransformations: proof of concept on Brewer’s spent grain (BSG).

　　

摘要
背景：在化学复杂基质中监测发酵仍然具有分析挑战性，因为多种代谢物会同时演变。常规测定法具有针对性和顺序性，且在实际样品中通常仅可获得部分注释。在本研究中，我们提出了一种结合光热红外光谱（O-PTIR）和一维卷积神经网络（1D-CNN）的掩码多标签分析工作流，用于快速筛选啤酒糟发酵。该方法将标准化合物光谱库与部分标记发酵光谱上的迁移学习相结合，而在微调过程中，掩码优化避免了对未注释类别的惩罚。
结果：首先使用十种参考化合物及其混合物的库来训练模型，然后利用淀粉、葡萄糖、乳酸和曲酸的质量标签将其适应于发酵样品。在最少样品制备后，分析了未接种、分离和顺序细菌/真菌发酵的上清液。预训练模型在标准库上显示了优异的内部验证结果。微调后的 1D-CNN 保持了较高的判别性能（宏平均 F1 值 = 0.950）。使用相同的保留 BSG 验证集对比一对多偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和支持向量机（SVM）模型，显示非线性模型优于线性化学计量学基线。预测的时间轮廓与测定法得出的阶段转变一致，特别是在细菌阶段葡萄糖消耗和乳酸积累，随后在真菌阶段淀粉消失和曲酸出现。
意义：这些结果支持使用多标签 O-PTIR 工作流来提供在部分标记、异质基质中快速且无需标记的关键代谢阶段识别，并突出了其作为生物过程监测的可转移分析策略的潜力。

引言
在农食品工业中，酿酒工业产生了大量的副产品。啤酒糟（BSG）是麦汁分离后剩下的固体残渣。长期以来被认为是最主要的固体副产品，通常据报道占酿酒固体残渣的约 85% [1], [2], [3]，并且每生产 100 L 啤酒就会产生约 20 kg 湿基 BSG [1], [3]。随着世界啤酒产量的增加，这代表着估计每年有 3640 万吨 BSG 产生 [4]，其中大部分仍然被转化为低价值利用，如主要作为动物饲料、填埋丢弃，仅有少量用于沼气生产 [2], [5]。

尽管如此，BSG 在成分上具有吸引力。据报道的数值随大麦品种和工艺条件而异，但 BSG 始终被描述为富含营养和木质纤维素材料。据报道，BSG 的成分包含 50 至 70% 的木质纤维素纤维材料、20 至 30% 的蛋白质、10% 的脂质以及矿物质和酚酸等微量营养素 [4], [5]。这种营养和功能性化合物的组合促使 BSG 高值化利用，转化为更高价值的食品和生物技术产品。然而，这种成分变异性使得直接解释常规分析测量结果变得复杂。

生物发酵是将 BSG 升级为高价值产品（有机酸、酶、维生素和生物燃料）的一种有前景的方法。最近的研究表明，预处理改善了木质纤维素基质的可及性 [3], [5]。例如，Saldarriaga-Hernandez 等人描述了一种集成生物炼制厂，利用灵芝对 BSG 进行生物脱木素。他们应用了稀酸或深共晶溶剂预处理，并与马氏克鲁维酵母进行同步糖化和发酵，实现了每克底物 0.46 克乙醇和真菌副产物 [6]。更广泛地说，顺序或共发酵策略（真菌与乳酸菌）被讨论为将复杂多糖转化为可发酵糖、产生有机酸和生物活性化合物的方法。然而，这些转化涉及几种共存的代谢物在复杂且依赖基质的环境中演变，这使得过程监测在分析上要求很高 [3], [5]。常规分析流程（色谱/质谱或酶测定法）可能缓慢、技能密集且通常具有针对性，这促使了对更快的过程控制和产品分析监测方法的兴趣。

红外（IR）光谱是一种快速的、大部分非破坏性的化学表征方法，因为中红外频率对应于化学键的基本振动模式，因此由此产生的吸收光谱可以解释为功能团和分子构象的分子“指纹” [7]。然而，常规红外显微光谱受限于中红外波长下的衍射（通常为数微米），并且当样品含有与红外波长相当的特征时可能会受到散射效应的影响 [8]。

光热红外（O-PTIR）显微镜通过使用脉冲可调红外激光（量子级联激光）激发分子振动，并使用共对齐的可见探测束检测局部光热响应（热膨胀和折射率变化），解决了这些限制。O-PTIR 能够在亚微米空间分辨率下进行红外测量，无需复杂的制备步骤或标记，同时也能提高信噪比 [8], [9]。另一个优势是振动模式的共定位。O-PTIR 仪器可以从同一点采集红外和拉曼光谱，当一种模式受到影响时（荧光克服拉曼信号或红外伪影），可以提高识别置信度。这使得它对于异质基质具有吸引力，因为它可以在有限制备的情况下提供化学信息丰富的光谱，并具有改进的空间精度。在发酵分析中，这可以提高代谢物的早期检测。这通过结合同时采集的 O-PTIR 和拉曼光谱到二维命中质量指标中，用于微塑料的聚合物识别得到了说明 [10]。最近，自动计算机控制的 O-PTIR 和拉曼工作流将气溶胶颗粒分析推进到 0.8 μm 直径，同时将分析时间减少了 30% [11]。除了微粒分析外，O-PTIR 也在生命科学背景下得到了验证，包括细胞测量和蛋白质及脂质特征的识别或亚微米映射 [12], [13], [14]。总之，这些研究表明 O-PTIR 非常适合在亚微米级别分析复杂和异质样品。与 FTIR 和 ATR-FTIR 不同，有效的局部采样区域主要由可见光焦点而不是量子级联激光调谐范围内变化的中红外波长决定。这为异质干燥沉积物上的点测量提供了相对一致的局部采样几何结构。

伴随着光谱仪器技术的进步，机器学习（ML）越来越多地用于从红外光谱中提取化学和生物信息，通过在数据集中实现自动化模式识别，而手动解释往往受限于光谱重叠、基质效应和非线性关系。最近的工作强调了其潜力和局限。尽管取得了重大进展，由于光谱库、有限或异质数据集以及解释的原因，从光谱中预测样品的结构和成分仍然是一项具有挑战性的任务。在实践中，稳健性和泛化性面临着仪器变异性的挑战。因此，在一个设备上开发的校准模型可能在另一个设备上失败，这促使了开放光谱的标准化和校准传输策略 [15]。

尽管如此，多项研究表明光谱学与 ML 结合可以达到很高的预测性能。在食品质量背景下，应用于近红外光谱的光梯度提升机预测了冷冻南极磷虾的储存时间，R2 = 0.988 [16]。此外，与偏最小二乘回归相关的 FTIR 定量了啤酒中选定的挥发性化合物，预测 R2 变化范围为 0.939 至 0.999 [17]。在微生物学中，O-PTIR 与监督神经网络结合实现了 97%（物种水平）和 91%（菌株水平）的宏 F1 得分，用于乳酸菌分类 [18]。尽管光谱学和 ML 的组合在定向预测任务中表现出强劲的性能，但大多数已发表的研究仍然集中在单标签分类或狭窄的回归目标上。相比之下，在演变中的发酵基质中同时推断几种化学重叠的代谢物仍然相对未被探索。

在本研究中，我们提出了一种机器学习辅助的 O-PTIR 工作流，用于同时识别 BSG 发酵过程中的多种代谢物。由于样品的自发荧光，未采集拉曼光谱。该工作流结合了十种化合物的标准光谱库、多标签 1D-CNN 以及基于部分标记发酵光谱的微调阶段。与常规的多类分类不同，多标签公式为每种化合物分配独立的概率，因此允许几种代谢物在同一光谱中共存。在基质适应过程中，掩码二元交叉熵从优化中排除了未注释的输出，同时保留了从十化合物库中学习到的共享光谱表示。为了确定深层架构是否提供优于常规方法的优势，使用相同的预处理光谱和相同的保留 BSG 验证集评估了一对多（偏最小二乘判别分析）PLS-DA 和（支持向量机）SVM 基线。本研究未进行高光谱成像或与 FTIR/ATR-FTIR 的直接比较。分析目标是通过联合检测淀粉、葡萄糖、乳酸和曲酸，提供关键代谢阶段的快速质量跟踪。

章节片段
啤酒糟与发酵设计
谷物在实验室中酿造以确保成分同质性：醪液在 67 °C 下维持 1 小时，然后在 75 °C 下维持 10 分钟，随后过滤并用热水剧烈冲洗以去除残留淀粉和杂质。十克所得的酒糟被分装到每个无菌瓶中，并在 115 °C 下灭菌 15 分钟以灭菌基质。冷却至室温后，建立了三个发酵条件（表 1）：
1. 阴性对照（Ctrl）：无

发酵动力学与化学测定
图 3 显示了发酵过程中淀粉、葡萄糖、乳酸和曲酸的质量浓度动力学。浓度通过常规测定法测量（第 2.4 节）。在阴性对照中，淀粉浓度随时间在 2.3 至 3.2 g/L 之间变化。在所有条件下的第 0 天也观察到类似的变异性，表明 BSG 基质中初始淀粉含量存在 substantial 异质性。相比之下，对照中的葡萄糖浓度保持在...

讨论
本研究引入了一种掩码多标签 O-PTIR 和 1D-CNN 工作流，用于分析部分标记、成分复杂的发酵基质，以啤酒糟作为概念验证应用。通过结合十种化合物的标准光谱库（包括二元至四元混合物）以及在部分标记发酵光谱上的特定基质适应，该工作流解决了 BSG 高值化过程中快速质量监测的需求，并...

结论
本研究展示了一种机器学习辅助的 O-PTIR 工作流，用于复杂发酵基质的快速质量多代谢物监测。在十化合物光谱库上预训练并使用少量部分标记 BSG 数据集微调的 1D-CNN，对淀粉、葡萄糖、乳酸和曲酸实现了高判别能力（宏平均 F1 值 = 0.950；平均 ROC-AUC = 0.993；平均 PR-AUC = 0.990）。预测的时间轮廓与化学测定趋势一致，表明该...

CRediT 作者贡献声明
Paul Lagneaux：写作 – 审查与编辑，写作 – 初稿，验证，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。Muhammad Hassan：写作 – 审查与编辑，方法论，概念化。Pascale Winckler：写作 – 审查与编辑，验证，监督，概念化。Yves Waché：写作 – 审查与编辑，验证，监督，调查，概念化。

数据可用性
数据仓库链接可在手稿中找到。

手稿准备过程中生成式 AI 和 AI 辅助技术声明
作者在撰写手稿过程中使用了人工智能辅助工具（OpenAI: ChatGPT 5.4 和 ChatGPT Codex）以支持语言编辑和核心 ML 编码，并提高清晰度和整体呈现。未使用工具生成实验数据或做出独立的科学决策。所有结果、解释和结论均经过作者审查和验证，作者对手稿的最终内容完全负责。

利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，可能影响本论文中报告的工作。

致谢：
P. Lagneaux 获得了 E-Scent 的博士奖学金。作者感谢 C. Rojas 的技术帮助。这项工作由 UMR PAM 和 DImaCell 资助。

Paul Lagneaux|Muhammad Hassan|Pascale Winckler|Yves Waché
河内科技大学与勃艮第欧洲大学、农业研究所、INRAE、UMR PAM 之间的“热带生物资源与生物技术”国际联合研究实验室，法国第戎，21000