《Applied Food Research》：Layer-by-layer encapsulation of
Lactobacillus rhamnosus using chitosan/hyaluronic acid: Enhanced gastrointestinal survival, thermal stability, and shelf life in an apple juice beverage
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益生菌在促进肠道健康和整体健康方面发挥着关键作用。然而，其有益效果取决于在加工、储存和胃肠道转运过程中维持足够的存活率。本研究开发了一种层层自组装（LbL）封装方法，使用壳聚糖（Ch）作为生物相容性和可生物降解的试剂，以及透明质酸（HA）作为外层保护层（因其粘
益生菌在促进肠道健康和整体健康方面发挥着关键作用。然而，其有益效果取决于在加工、储存和胃肠道转运过程中维持足够的存活率。本研究开发了一种层层自组装（LbL）封装方法，使用壳聚糖（Ch）作为生物相容性和可生物降解的试剂，以及透明质酸（HA）作为外层保护层（因其粘弹性以及在胃肠道转运过程中增强涂层完整性），以增强鼠李糖乳杆菌PTCC 1637的稳定性。实现了83.3±0.08%的封装效率，并通过交替的ζ电位变化以及傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）分析确认了Ch/HA多层涂层的成功形成。多层包被的益生菌在模拟胃肠道条件下表现出显著改善的抵抗力，存活率仅降低2.63 log CFU/mL，而游离细胞降低7.07 log CFU/mL（P<0.05），这归因于Ch/HA多层涂层减少了它们在储存过程中暴露于酸性pH、消化酶、胆盐、热应激和环境损伤。此外，封装细胞表现出显著改善的热稳定性，在75°C下实现了高达156.25的保护因子。在苹果汁中冷藏储存90天期间，封装的鼠李糖乳杆菌表现出更高的存活率保持，在天然和商业果汁中仅降低0.76 log CFU/mL，而游离细胞分别降低1.52和1.39 log CFU/mL。总体而言，结果表明使用壳聚糖和透明质酸的LbL封装具有作为增强食品系统中益生菌稳定性的多功能递送平台的潜力。
益生菌（probiotics）在促进肠道健康方面具有重要作用，但其在食品加工、储存及胃肠道（gastrointestinal, GI）转运过程中面临的酸性环境、消化酶、胆盐及热应激等胁迫导致存活率显著下降，成为功能食品开发的关键瓶颈。传统微胶囊化技术虽能提供一定保护，但多层封装系统的涂层完整性、热稳定性及长期储存性能仍有待提升。壳聚糖（chitosan, Ch）作为阳离子多糖具有良好生物相容性，透明质酸（hyaluronic acid, HA）因其粘弹性可增强涂层结构，二者结合可能构建更致密的屏障。本研究旨在开发基于Ch/HA的层层自组装（layer-by-layer, LbL）封装系统，以提升鼠李糖乳杆菌（*Lactobacillus rhamnosus* PTCC 1637）在模拟胃肠道、热处理及苹果汁储存中的稳定性。论文发表在《Applied Food Research》。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：通过静电层层自组装（LbL）技术，以壳聚糖（Ch）为内层、透明质酸（HA）为外层，在益生菌细胞表面逐层沉积聚电解质；利用ζ电位（zeta potential）分析监测表面电荷反转，傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）表征涂层结构；通过模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）实验评估胃肠道存活率；通过55°C、65°C、75°C热处理评估热稳定性；以苹果汁（天然和商业）为模型饮料，在4°C储存90天评估储存稳定性，并监测pH及感官属性。
研究结果如下：
**3.1 细菌生长曲线**：通过测定生长曲线，确定约24小时（稳定期）为最佳收获时间，此时细胞对胁迫的抵抗力增强。
**3.2 ζ电位分析**：自由细胞ζ电位为-7.56 mV（pH 7），沉积Ch后变为+15.75 mV，再沉积HA后变为-10.55 mV，经钙盐和磷酸盐交联后升至+9.62 mV，表明通过静电相互作用成功构建了Ch/HA多层涂层。
**3.3 形态学与FTIR分析**：SEM图像显示，自由细胞呈典型杆状，封装后形成光滑球形颗粒，无游离细胞；FTIR光谱中Ch的酰胺I带（1597→1578 cm?1）位移及多糖指纹区变化，证实了Ch与HA间的静电相互作用和氢键形成，支持多层结构的建立。
**3.4 模拟胃肠道条件下的存活率**：在SGF（pH 2.0）中60分钟后，自由细胞存活率降低7.07 log CFU/mL至约0.93 log CFU/mL，而封装细胞仅降低2.63 log CFU/mL，维持约5.37 log CFU/mL（P<0.05）；后续在SIF（pH 8.0，含胆盐和胰酶）中，封装细胞仍保持约5.7 log CFU/mL，高于10? CFU/mL的最低推荐阈值，证明Ch/HA涂层有效阻隔酸、酶和胆盐的侵害。
**3.5 热稳定性**：在55°C、65°C、75°C处理10分钟后，封装细胞的存活率均显著高于自由细胞；75°C时自由细胞仅剩约2.5 log CFU/mL，而封装细胞保持约4.7 log CFU/mL，保护因子（protection factor, PF）达156.25（P<0.001），表明多层涂层通过限制热传递和结构支撑提升了热抵抗能力。
**3.6 饮料模型中的存活率**：在苹果汁（天然和商业）中4°C储存90天，封装细胞存活率仅降低0.76 log CFU/mL，而自由细胞分别降低1.52和1.39 log CFU/mL；pH监测显示封装样品代谢更温和，维持了果汁酸度稳定性，证明涂层有效屏蔽了低pH和有机酸的环境胁迫。
**3.7 感官评价**：采用5分喜好度评分，所有样品（含封装或自由益生菌的天然与商业果汁）在风味、质地、颜色、气味和澄清度方面均获得3.3至4.7分，无显著差异（P>0.05），表明封装未影响消费者接受度。
讨论部分总结：Ch/HA多层涂层通过强静电作用形成致密聚电解质网络，作为物理化学屏障，有效减少氢离子、消化酶、胆盐及高温对益生菌的损伤，同时保持细胞代谢活性适度下降以延长储存期。该系统的热保护因子优于既往报道的乳清蛋白/黄原胶或明胶/HA系统，且在酸性果汁中的长期稳定性显著优于传统壳聚糖-海藻酸盐封装。感官评价结果证实了其商业可行性。研究结论：本研究成功开发了基于壳聚糖/透明质酸（Ch/HA）的层层自组装（LbL）封装系统，用于鼠李糖乳杆菌PTCC 1637。通过强静电相互作用形成的致密多层涂层为益生菌细胞提供了稳健保护。封装益生菌在多种胁迫下表现出显著增强的稳定性：模拟胃肠道条件下的存活率损失较自由细胞降低超过60%，热抵抗性显著提高（75°C时保护因子达156.25），且在苹果汁中4°C储存90天后仍维持更高存活率，对pH和感官属性影响极小。据研究人员所知，这是首批证明Ch/HA多层系统在酸性饮料基质中保护益生菌有效性的研究之一。壳聚糖的强粘附和pH响应特性与透明质酸的粘弹性和生物相容性协同作用，构建了有效的多屏障架构，解决了现有封装技术的关键局限性。总体而言，Ch/HA LbL方法为开发具有改善胃肠道递送和延长保质期的功能性益生菌食品和饮料提供了有前景的策略。进一步需开展体内研究和放大研究以充分实现其商业潜力。
