自生成纤维素支架内的微生物共培养为控制植物汁发酵提供了工具包

《Applied Food Research》：Microbial co-cultures within self-generated cellulose scaffolds offer toolkits for controlling plant juice fermentation

　　

本研究的目的是在自生成纤维素支架（SC-CS）内建立合成共培养，从而为植物汁的受控发酵提供鲁棒的工具包。研究人员的方法是将纤维素支架的生长与携带目标代谢功能的微生物细胞的同时整合相结合。研究人员发现，植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）C2、短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）POM4和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）JB6C2与木葡糖酸醋杆菌（Komagataeibacter xylinus）DSM2325相容，使得共培养和混合物种纤维素膜（pellicle）的形成为可能。当SC-CS作为接种物用于后续培养时，生物膜（biofilm）的微生物组成在富含营养的合成培养基和模拟食品加工环境的底物（胡萝卜汁，CJ）中均得以保留，尽管在浮膜形成的时间上出现了差异。在胡萝卜汁发酵过程中，SC-CS的糖消耗和代谢物产生部分反映了与K. xylinus DSM2325相关的单个菌株的初级代谢。还观察到了微生物相互作用和交叉喂养的明显例子。每个SC-CS内的微生物相互作用在塑造发酵胡萝卜汁中游离酚类化合物和挥发性化合物（VOC）的谱图方面也发挥了关键作用。

**论文解读：自生成纤维素支架内的合成共培养用于植物汁发酵控制**

**1. 研究背景与问题**

发酵食品与饮料历史悠久，传统发酵常依赖自然微生物群落（MC），其复杂网络相互作用决定了产品的质地、风味、安全性与营养特性。然而，自然MC的动态性、对环境变化的敏感性以及稳定维持的困难，使其工业化管理极具挑战。合成共培养（SC）——由两种或以上明确菌株组合而成——被视为一种有前景的替代方案，能在减少副反应的同时保留更广泛的代谢能力，并可通过“一锅法”系统设计定制生态系统。然而，SC应用的主要障碍在于确定最适功能亚群落、确保其有效合作以形成稳定且功能性的群落，以及调控其代谢功能与稳定性。受康普茶（kombucha）天然模型启发，该研究旨在建立自生成纤维素支架（SC-CS）内的合成共培养，为植物基果汁的受控发酵提供工具包，重点解决SC-CS随时间维持稳定性和功能性的关键挑战。

**2. 研究内容与结论**

研究人员建立了由产纤维素醋酸菌（木葡糖酸醋杆菌，Komagataeibacter xylinus DSM2325）与乳酸菌（LAB，植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum C2或短乳杆菌Levilactobacillus brevis POM4）或酵母（粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe JB6C2）组成的二元共培养，通过连续传代培养获得自组装、自传播的SC-CS。这些SC-CS在合成培养基和胡萝卜汁（CJ）中均能维持微生物组成稳定，并成功发酵CJ，显著改变其糖、有机酸、游离酚类化合物及挥发性有机物（VOC）谱图。研究证实了SC-CS作为功能性、可重复的微生物平台用于植物基底物受控发酵的可行性，并观察到微生物间相互作用与交叉喂养现象。该研究发表于《Applied Food Research》。

**3. 关键技术方法**

为建立SC-CS并评估其功能，研究人员采用了以下主要技术方法：
- **共培养生长动力学分析**：在合成培养基（MRS或YPD肉汤）中，将LAB或酵母与K. xylinus DSM2325进行二元共培养，通过平板计数法监测液体相和生物膜中细胞密度，评估菌株间相容性与相互作用。
- **扫描电子显微镜（SEM）**：分析成熟SC-CS生物膜的表面形态与结构，比较不同菌株组合及生长底物（合成培养基与CJ）对纤维素纤维网络和细胞嵌入程度的影响。
- **胡萝卜汁（CJ）发酵试验**：以CJ为模型食品基质，将成熟SC-CS用作接种物，进行4个7天循环的连续传代发酵，评估SC-CS的自组装、自传播能力及微生物组成稳定性。
- **高效液相色谱（HPLC）**：定量检测CJ中葡萄糖、果糖、甘露醇、乳酸、乙酸和乙醇的浓度，评估代谢物谱。
- **液相色谱-质谱联用（LC-MS）**：分析CJ中游离酚类化合物（如丁香醛、橙皮苷、水杨酸、绿原酸等）的谱图变化。
- **气相色谱-质谱联用（GC-MS）**：分析CJ中挥发性有机化合物（VOC）的谱图，评估风味相关代谢物。菌株来源：LAB和酵母来自巴里大学（University of Bari Aldo Moro）土壤、植物与食品科学系培养物保藏库，K. xylinus DSM2325来自莱布尼茨研究所DSMZ（德国微生物与细胞培养物保藏中心）。

**4. 研究结果（保留小标题）**

**3.1 生长动力学**
通过单培养与共培养的细胞密度比较，未观察到菌株间明确的协同或拮抗相互作用（P > 0.05）。但浮膜形成时间因菌株组合而异：与L. plantarum C2共培养时，生物膜形成提前（3天）；与Sc. pombe JB6C2共培养时与单培养一致（4天）；与Le. brevis POM4共培养时延迟（5天）。多数LAB和酵母细胞存在于液体相，而K. xylinus DSM2325主要存在于纤维素膜中。

**3.2 SC-CS建立条件**
在初始筛选后，K. xylinus DSM2325与C2、POM4或JB6C2共培养时均能形成浮膜。经4个传代循环后，所有共培养菌株在生物膜中仍可检测，功能菌株（LAB或酵母）细胞密度约为4–5 Log CFU g^-1，K. xylinus DSM2325稳定维持在约8.5 Log CFU g^-1。SEM显示，不同菌株组合导致生物膜形态差异：与L. plantarum C2共培养时纤维网络致密且厚；与Le. brevis POM4或Sc. pombe JB6C2共培养时则形成更松散、多孔的异质网络。

**3.3 胡萝卜汁发酵**
所有SC-CS在CJ中经4个传代循环后仍保持自组装与自传播能力，微生物组成相对稳定。功能菌株主要存在于液体相（细胞密度约7–9 Log CFU mL^-1），K. xylinus DSM2325主要存在于纤维素膜（约7–8 Log CFU g^-1）。浮膜形成时间差异延续：与L. plantarum C2共培养时最早，其次为Sc. pombe JB6C2，Le. brevis POM4最晚。纤维素膜重量：与L. plantarum C2共培养时最重（湿重15.49 g 100 mL^-1，干重0.37 g 100 mL^-1），显著高于其他组合。SEM显示CJ中生物膜形态与合成培养基中不同，且因菌株组合而异。

**3.4 SC-CS对胡萝卜汁代谢组学谱的影响**
SC-CS发酵显著改变了CJ的糖、有机酸、甘露醇和乙醇浓度。与L. plantarum C2共培养导致乳酸积累（2.26 g L^-1）；与Le. brevis POM4共培养导致甘露醇（11.53 g L^-1）和乙酸（0.53 g L^-1）积累，果糖优先消耗；与Sc. pombe JB6C2共培养时，乙醇未积累，但中间阶段（第2天）达到峰值（6.75 g L^-1）后逐渐下降，表明乙醇被K. xylinus DSM2325代谢。游离酚类化合物谱显示，SC-CS发酵增加了某些酚类化合物（如丁香醛、橙皮苷、水杨酸等）含量，而特定分子（如槲皮素、4-羟基苯甲醛）在单菌发酵中显著升高。VOC谱聚类分析表明，SC-CS发酵产生独特代谢指纹，如乙酰甲基甲醇（acetoin）在含L. plantarum C2或Sc. pombe JB6C2的SC-CS中显著合成。

**5. 讨论总结与结论翻译**

**讨论总结**：研究表明，L. plantarum C2、Le. brevis POM4和Sc. pombe JB6C2与K. xylinus DSM2325相容，能形成混合物种生物膜。SC-CS在合成培养基和CJ中均能自组装与自传播，微生物组成稳定，表现出空间分区（K. xylinus主要在膜中，LAB/酵母主要在液体相），类似于传统康普茶生态系统。浮膜形成时间差异可能与菌株释放的细胞内成分或信号分子有关，其中L. plantarum C2的群体感应途径可能参与调控。生物膜形态受微生物类型和底物组成共同影响。糖消耗与代谢物产生部分反映单个菌株的初级代谢，但同时也观察到交叉喂养：例如，Sc. pombe JB6C2产生的乙醇被K. xylinus DSM2325氧化，支持纤维素合成，耦合了酵母发酵活性与膜维持。SC-CS内的微生物相互作用对游离酚类化合物和VOC谱有显著影响，决定了每个SC-CS系统的独特代谢指纹。

**结论翻译**：在本研究条件下，研究人员开发了具有原位自组装和自传播能力的SC-CS系统。该方法的一个关键优势是在纤维素膜形成过程中直接由微生物细胞进行功能化，无需单独的固定化步骤。SC-CS进一步提高了发酵效率和可控性，简化了过程管理并通过便捷的细胞回收与再利用降低成本，同时能够生产具有独特感官、营养和功能特性的新型发酵饮料。研究结果表明，SC-CS是动态的，能适应环境变化，这一点从它们从合成培养基转移到CJ中得到证实。这种多功能性使得能够整合多种微生物，创建空间组织的生物催化级联反应，并支持扩展到不同植物基质的发酵。然而，可行性取决于微生物与K. xylinus DSM2325的相容性、纤维素膜的形成以及长期生物膜稳定性。未来工作应研究SC-CS内的微生物相互作用，重点关注代谢物交叉喂养和交流机制，以阐明营养相互作用如何影响SC-CS的形态、稳定性、恢复力和性能。