《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Rapid purity and charge-variant analysis of bispecific antibodies using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry
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双特异性抗体疗法具有同时结合两个靶点的能力，这为疾病治疗开辟了新途径。BsAbs由不同的重链和轻链组成，需要正确组装以形成适当的异源二聚体。然而，在开发和生产过程中，可能会发生链的错误组装，这会影响BsAbs的纯度，因此需要对其进行监测。在这里，研究人员展示了
双特异性抗体疗法具有同时结合两个靶点的能力，这为疾病治疗开辟了新途径。BsAbs由不同的重链和轻链组成，需要正确组装以形成适当的异源二聚体。然而，在开发和生产过程中，可能会发生链的错误组装，这会影响BsAbs的纯度，因此需要对其进行监测。在这里，研究人员展示了微流控毛细管电泳-质谱联用技术(MCE-MS)在快速进行BsAb样品纯度和蛋白质形式分析方面的实用性。MCE能够从模型BsAb中分离同源二聚体抗体种类以及电荷变体，而MS检测则提供了这些BsAb电荷变体和糖型的鉴定。低分辨率MCE-MS方法允许在不到3分钟内对同源二聚体含量进行定量测定，而高分辨率MCE-MS方法则在15分钟内提供了BsAb疗法的详细电荷变体和糖型图谱。研究人员将这两种方法串联应用于大型生物类似药BsAb样品集的克隆筛选和下游纯化监测。首先，使用快速MCE-MS方法建立BsAb细胞系样品和纯化工艺中间体的同源二聚体-异源二聚体比率。接下来，基于测定的BsAb纯度，选择感兴趣的样品并用高分辨率MCE-MS方法进行分析，得出质量图谱，从而允许合理的克隆选择和纯化过程的优化。总体而言，所开发的MCE-MS工作流程在加速和增强BsAb开发和生产过程中的决策方面展现出巨大潜力。
这项研究发表于《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。
研究背景与意义
自1986年首个单克隆抗体获批以来，抗体类疗法不断发展。双特异性抗体（BsAb，能够同时结合两个不同靶点的工程化抗体）能够同时结合两个不同靶点，为疾病治疗提供了新途径。治疗性BsAbs通常基于免疫球蛋白G（IgG，主要由浆细胞分泌的血清蛋白）并包含两条不同的重链（HCA和HCB）和轻链（LCA和LCB），这些链需在单细胞内正确组装形成异源二聚体。若组装错误，会形成仅结合单一靶点的同源二聚体（由相同重轻链组成的二聚体）等杂质，从而降低药效。尽管已有“Knobs-into-holes”等序列工程策略促进正确组装，错配现象仍频发，因此需在开发生产的各个阶段持续监测BsAb纯度。此外，传统的分析方法如体积排阻色谱（SEC，基于分子大小进行分离的液相色谱技术）或反相液相色谱（RPLC，基于疏水性差异进行分离的液相色谱技术）串联质谱在分离错配抗体方面效果不佳，易受离子抑制影响，难以准确定量低丰度变体；而离子交换色谱（IEX，基于电荷差异分离分子的色谱技术）、毛细管区带电泳（CZE，一种基于电场作用下毛细管内不同电荷分布实现分离的电泳技术）和微芯片成像毛细管等电聚焦等电荷变体分析（CVA，基于净电荷差异分离异构体的技术）虽能提供高分辨率，但分析时间长，难以满足生物制药行业对大样本集的快速筛选需求。为克服这些限制，研究人员开展了基于微流控毛细管电泳-质谱联用技术（MCE-MS，在微流控芯片蚀刻玻璃通道中进行CZE并耦合芯片内纳米电喷雾电离的质谱检测技术）的分析方法研究，以实现快速且高信息量的纯度与电荷变体评估，这对加速抗体开发与生产决策具有重要意义。
关键技术方法
本研究的样本队列来源于生物类似药BsAb细胞系培养上清及下游纯化各阶段中间体。研究人员主要采用MCE-MS技术，通过优化背景电解质（BGE，用于维持电泳分离所需pH值和电导率的缓冲溶液）的pH值，并结合高分辨率原生芯片与高速芯片，分别建立了用于快速纯度定量的高通量方法和用于详细蛋白变体表征的高分辨率方法。数据处理通过基峰电泳图（BPE，质谱中每个时间点最高丰度离子的图谱）和总离子电泳图（TIE，质谱中所有离子强度加和的图谱）完成相对定量及质谱去卷积分析。
研究结果
BsAb分析的MCE-MS方法开发
研究人员评估了BGE pH对分离的影响。将BGE pH从5.5降至5.0，增加了蛋白质净电荷和电泳淌度，成功分离了同源二聚体（HDA-A和HDB-B）与BsAb。若进一步降至pH 4.5，分辨率显著下降。为提高通量，研究人员使用短分离通道和高场强的高速芯片，在不到2分钟内实现了三种抗体物种的基线分离，称为高通量方法；而使用长分离通道的高分辨率原生芯片结合pH 5.0的BGE，则用于详细电荷变体分析，称为高分辨率方法。同时，高通量方法采用15,000的低质谱分辨率以提升信噪比和灵敏度，而高分辨率方法选择30,000的分辨率以平衡信号强度与质量分辨能力。
BsAb和同源二聚体的相对定量
研究发现不同抗体物种在质谱中具有不同的响应因子（RF，校正不同分子质谱响应差异的系数），HDB-B响应偏高，而HDA-A略低，这与其等电点相关。通过构建校准曲线并应用RF进行校正，测得R
2大于0.99，定量结果的准确度偏差低于10%。此外，为免除耗时的蛋白A纯化步骤，研究人员直接稀释细胞培养上清进行分析，并引入基质因子（MF，校正复杂基质引起的离子抑制效应的系数）以补偿基质效应，从而进一步提高了分析通量。
生物类似药BsAb克隆筛选
在早期开发中，仅依据总抗体滴度选择克隆可能会偏好整体产量高但BsAb纯度低的细胞系。对32个克隆细胞系的分析表明，总抗体滴度高的克隆其BsAb纯度不一定高。结合高通量方法测定的纯度数据计算出BsAb滴度后，挑选前8个克隆利用高分辨率方法分析关键质量属性。结果显示，不同克隆在去岩藻糖基化、唾液酸化和半乳糖基化等糖型指标上与原研药存在显著差异，这些指标影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC，一种免疫细胞杀伤靶细胞的机制）等效应。在电荷变体方面，检测到N末端谷氨酸转化为焦谷氨酸、重链B前七个氨基酸截断等碱性变体，以及天冬酰胺脱酰胺化、糖化和羧甲基赖氨酸等酸性变体。综合质量属性与纯度打分后，选出了最佳克隆。
BsAb下游纯化过程评估
在下游纯化过程中，Protein A色谱和阴离子交换层析（AEX，利用电荷差异去除杂质蛋白的色谱技术）步骤后BsAb纯度未见显著提升。而阳离子交换层析（CEX，基于电荷差异分离蛋白的色谱技术）的洗脱馏分F2至F4表现出最高纯度，其中F3纯度达99.2%，合并后纯度约为97%并保持至原液阶段。高分辨率方法比较起始与最终原液样品发现，电荷变体的相对丰度均有所降低，表明该纯化过程未诱发有害的电荷修饰，反而降低了杂质丰度。
结论
研究人员开发了一种由两种易于互换的MCE-MS方法组成的工作流程。高通量方法仅需3分钟即可分离同源二聚体与BsAb，并通过响应因子校正提高了纯度测定的准确性；高分辨率方法则实现了电荷变体和相关蛋白变体的表征，进而评估包括糖基化图谱和电荷相关修饰在内的关键质量属性。这两种方法均可直接应用于稀释后的细胞培养上清，无需预先进行蛋白A纯化。串联使用该工作流程可先对大样本集进行纯度快速筛选，再对选定样本进行深入表征。该研究展示了其在加速和增强BsAb开发与生产各阶段决策方面的巨大潜力。
