[苯并[a]芘诱导的METTL3过表达通过LTB4R mRNA的m6A修饰和增强的Treg浸润加速肾细胞癌进展]

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Benzo[ a]pyrene-induced METTL3 overexpression accelerates renal cell carcinoma progression via m6A modification of LTB4R mRNA and enhanced Treg infiltration

　　

苯并[a]芘是一种广泛存在的环境污染物，也是一种具有明确致癌特性的多环芳烃。然而，BaP促进肾细胞癌（RCC）进展的分子机制，特别是涉及表观遗传修饰和免疫调节的机制，仍不清楚。在这项研究中，研究人员整合了来自癌症基因组图谱（TCGA）和比较毒理学数据库（CTD）的转录组数据，以鉴定RCC中BaP相关的N6-甲基腺苷（m⁶A）相关基因。研究人员建立了一个基于m⁶A的预后特征，定义了分子亚型，并使用苯并[a]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物（BPDE）诱导的体外恶性转化模型、BaP暴露的小鼠异种移植模型和人类RCC标本进一步验证了关键轴。研究发现，BaP暴露上调了甲基转移酶样蛋白3（METTL3）的表达并增加了整体m⁶A水平。在机制上，METTL3介导的白三烯B4受体1（LTB4R）mRNA的m⁶A修饰被m⁶A阅读器蛋白胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）识别，从而稳定了LTB4R mRNA并因此增加了LTB4R表达。METTL3/LTB4R轴促进了BPDE诱导的恶性表型，包括肾上皮细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，LTB4R过表达的肿瘤细胞招募了调节性T细胞，并且与调节性T细胞共培养通过METTL3/LTB4R轴进一步增强了恶性行为。在体内实验中，抑制或敲除METTL3可抑制肿瘤生长，而过表达LTB4R则逆转了这些效应。研究人员的发现表明，BaP暴露通过METTL3介导的LTB4R的m⁶A修饰和调节性T细胞浸润促进RCC进展，为环境致癌的表观转录组学机制提供了新见解，并将METTL3/LTB4R轴确定为BaP相关RCC的潜在治疗靶点。

多环芳烃是一大类具有致癌、致畸和致突变性的环境污染物。苯并[a]芘作为其中被广泛研究的代表，进入人体后与芳烃受体相互作用并诱导肿瘤形成。肾细胞癌（RCC）是泌尿系统主要恶性肿瘤，由于晚期转移和局部复发，患者预后较差。以往研究表明，BaP暴露与RCC发生风险增加相关，且BaP毒性可能伴随N6-甲基腺苷（m⁶A）等表观遗传失调。然而，BaP促进RCC进展的分子机制，特别是表观遗传修饰与免疫微环境的相互作用，仍不清楚。因此，开展此项研究旨在揭示BaP及其代谢物诱导RCC的m⁶A修饰相关机制，并寻找潜在治疗靶点。研究人员整合多组学数据筛选关键基因，构建预后风险模型，并通过体外细胞模型和体内动物实验进行验证。研究得出结论，BaP暴露通过上调METTL3表达，增加LTB4R mRNA的m⁶A修饰水平，进而通过IGF2BP1依赖性途径稳定该mRNA并促进其表达，最终加速肾细胞癌进展并调节调节性T细胞浸润。该研究揭示了环境致癌物、表观转录组调控与肿瘤免疫微环境重塑之间的新联系。论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上，为环境致癌机制提供了新见解，并确定了METTL3/LTB4R轴作为治疗BaP相关RCC的潜在治疗靶点。

研究人员主要采用以下关键技术方法：从比较毒理学数据库（CTD）和癌症基因组图谱（TCGA）数据库获取RCC样本队列（肿瘤=530，正常=72）及临床数据，结合生物信息学分析和LASSO回归构建预后风险模型。利用BPDE诱导HK2细胞建立体外恶性转化模型，采用BaP暴露的ICR小鼠和皮下异种移植的BALB/c裸鼠构建体内模型。使用甲基化RNA免疫沉淀和SELECT-qPCR鉴定m⁶A修饰位点；通过RNA免疫沉淀和放线菌素D追踪实验分析mRNA稳定性；利用Transwell系统进行肿瘤细胞与Treg细胞共培养以探究相互作用。

Identification of BaP-related m⁶A-associated genes with prognostic significance in RCC
通过整合CTD和TCGA数据并进行差异表达基因分析和单变量Cox回归分析，鉴定出490个与RCC预后显著相关的BaP相关m⁶A修饰基因，表明这些基因在RCC中存在广泛失调并具有预后生物标志物潜力。

BaP-related m⁶A methylation-modified genes define distinct molecular subtypes with different prognostic and immune characteristics in RCC
基于上述基因的表达谱，将RCC患者聚类为三种不同的分子亚型。功能富集和免疫浸润分析表明，这些亚型在预后、通路活性和免疫细胞浸润方面存在显著差异，其中Cluster C预后最差且具有显著的免疫异质性，说明BaP相关m⁶A修饰模式与RCC临床结局和免疫特征密切相关。

Identification of METTL3-centered prognostic signatures associated with BaP-related m⁶A modification in RCC
通过LASSO回归构建风险模型，发现METTL3在预后网络中起核心调控作用，且其与SNRPA1、LTB4R等下游靶基因表达显著相关。生存分析证实这些分子与RCC患者总生存期密切相关。

Pan-cancer analysis highlights the expression characteristics and immune relevance of SNRPA1 and LTB4R
泛癌分析显示SNRPA1和LTB4R在多种癌症中异常表达，且与肿瘤免疫浸润广泛相关。在RCC中，这两个基因的拷贝数变异（CNV）状态与免疫细胞浸润水平改变相关，提示其可能通过调节免疫微环境促进肿瘤进展。

BaP/BPDE exposure upregulates METTL3 expression and promotes BPDE-induced malignant transformation
在体外和体内模型中证实，BaP/BPDE暴露显著上调METTL3表达并增加整体m⁶A水平。敲除METTL3或使用抑制剂STM2457可显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤生长，表明METTL3是维持BPDE诱导的恶性表型的关键因素。

METTL3 regulates m⁶A modification of LTB4R mRNA upon BaP/BPDE exposure
通过MeRIP-qPCR检测发现BPDE转化细胞及癌组织中LTB4R mRNA存在明显的m⁶A修饰富集，而敲除METTL3则显著降低该修饰。通过SELECT-qPCR验证了LTB4R mRNA上A133和A1376位点的m⁶A修饰依赖于METTL3。

The m6A reader protein IGF2BP1 stabilizes LTB4R mRNA and upregulates its expression
研究发现LTB4R在恶性转化中表达上调。敲低IGF2BP1而非IGF2BP2或IGF2BP3会显著降低LTB4R mRNA表达并加速其衰变。RIP-qPCR证实IGF2BP1与LTB4R mRNA结合，表明IGF2BP1作为阅读器蛋白识别并稳定m⁶A修饰的LTB4R转录本。

LTB4R mediates the oncogenic function of METTL3 in BPDE-induced renal cancer progression
功能实验显示，敲低LTB4R抑制了细胞恶性表型。在METTL3敲除的细胞中过表达LTB4R可部分恢复其增殖、迁移和侵袭能力，体内实验也证实过表达LTB4R可逆转METTL3缺失对肿瘤生长的抑制，证明LTB4R是METTL3促癌功能的关键介质。

Treg cells promote malignant phenotypes through the METTL3/LTB4R axis
趋化实验表明，BPDE诱导的恶性转化细胞增加了Treg迁移，敲除METTL3减少迁移而过表达LTB4R恢复迁移。共培养实验证实Treg细胞通过METTL3/LTB4R轴增强了肾癌细胞及BPDE转化细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

在讨论与结论部分，研究人员指出，尽管研究揭示了Treg细胞通过该轴促进恶性表型，但具体涉及的细胞因子仍不明确，且需要更大的独立临床队列来验证METTL3/LTB4R轴的预后价值及其与免疫浸润和免疫治疗反应的关联。研究最终得出结论，BaP/BPDE暴露上调了METTL3表达，增加了LTB4R mRNA的m⁶A修饰，并通过IGF2BP1依赖性的mRNA稳定作用增强了LTB4R表达。METTL3/LTB4R轴促进了BPDE诱导的恶性转化、RCC进展以及Treg相关的促瘤效应。这些发现揭示了环境致癌物暴露、m⁶A表观转录组调控与RCC免疫微环境重塑之间的新联系，提示靶向METTL3/LTB4R轴可能成为治疗BaP相关肾癌发生的潜在治疗策略。