《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Sub?chronic dietary exposure to environmentally relevant doses of di?(2?ethylhexyl) adipate (DEHA) induces hepatic steatosis in female mice via disrupting the PPARγ pathway and inducing endoplasmic reticulum stress:
In vivo and
in vitro evidence
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己二酸二(2-乙基己基)酯(DEHA)，最初被视为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)增塑剂的更安全替代品，广泛用于食品包装和消费品。尽管其在食品中检测水平高且人体暴露已确定，但环境相关剂量DEHA的健康影响仍知之甚少。本研究的主要目的是通过结合体内和体
己二酸二(2-乙基己基)酯(DEHA)，最初被视为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)增塑剂的更安全替代品，广泛用于食品包装和消费品。尽管其在食品中检测水平高且人体暴露已确定，但环境相关剂量DEHA的健康影响仍知之甚少。本研究的主要目的是通过结合体内和体外模型，研究亚慢性膳食暴露于DEHA是否破坏雌性小鼠的代谢稳态，并阐明其潜在机制。在本研究中，27只4周龄、初始体重相似的雌性C57BL/6J小鼠被随机分为四组（对照组(n=6)、溶剂对照组(n=6)、低剂量DEHA组(n=7)和高剂量DEHA组(n=8)），小鼠饮食中DEHA浓度分别为0.087和18.2 mg/kg，进行15周亚慢性暴露。DEHA显著增加体重、脂肪量、空腹血糖、血清胆固醇，并诱导肝脂肪变性，但不影响食物摄入或能量消耗。非靶向代谢组学分析发现DEHA暴露小鼠肝脏组织中脂质代谢物显著升高。进一步的机制研究表明，DEHA上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)信号通路和内质网(ER)应激相关基因的表达。在小鼠α小鼠肝12(AML12)和人肝细胞系L02中，DEHA直接诱导剂量依赖性脂质积累。用特异性抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)药理学抑制ER应激可减弱DEHA诱导的脂质积累和脂肪生成基因表达。这些发现表明，环境水平DEHA暴露通过扰乱PPARγ信号通路和上调ER应激相关基因促进雌性小鼠肥胖和肝脂肪变性，突显了DEHA在女性中一个显著且此前被低估的健康风险，并呼吁重新评估其作为内分泌干扰化学物质的安全性。
**研究背景与问题**
己二酸二(2-乙基己基)酯(DEHA)作为一种广泛使用的增塑剂，最初被开发为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的更安全替代品，用于食品包装、玩具和医疗器械。然而，尽管DEHA在食品中检测浓度高（奶酪中高达429 mg/kg，鲜肉中151 mg/kg）且人体暴露已确认，但其环境相关剂量的健康影响仍不明确。流行病学数据提示DEHA暴露与儿童血清甘油三酯升高相关，且女性对内分泌干扰物(EDCs)的代谢效应可能更敏感，但缺乏针对雌性模型的长期代谢毒性研究。因此，亟需探究亚慢性、环境相关膳食暴露下DEHA对雌性小鼠代谢稳态的作用及其机制。
**研究内容与结论**
研究人员通过体内和体外模型，系统评估了DEHA的代谢毒性。雌性C57BL/6J小鼠（27只，4周龄）随机分为四组，分别给予标准饲料（对照组）、乙醇溶剂对照、低剂量DEHA（0.087 mg/kg饲料）和高剂量DEHA（18.2 mg/kg饲料），暴露15周，模拟人类环境暴露水平。结果显示，DEHA暴露显著增加体重、体脂百分比、空腹血糖、血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，并诱导肝脂肪变性（肝内甘油三酯(TG)升高、肝细胞肥大、小叶炎症），但不影响摄食量和体温。低剂量DEHA效应更为显著，呈现非单调剂量-反应关系。体外实验使用小鼠AML12和人L02肝细胞，证实DEHA直接诱导剂量依赖性脂质积累。机制上，DEHA通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)信号通路（上调Cd36、Fatp4、Fabp4等靶基因）和诱导内质网(ER)应激（上调Grp78、Xbp1、Chop，并激活PERK-EIF2α磷酸化）促进脂肪生成。使用ER应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)预处理可显著减轻DEHA引起的脂质积累和脂肪生成基因表达。该研究首次揭示了环境相关剂量DEHA通过PPARγ和ER应激双重通路诱导雌性小鼠肥胖和肝脂肪变性，挑战了DEHA作为安全替代品的传统观点，为重新评估其安全性及制定针对性监管政策提供了关键实验证据。论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。
**主要关键技术方法**
- 动物模型：雌性C57BL/6J小鼠（4周龄，27只，购自GemPharmatech Co., Ltd, 南京）随机分组，膳食暴露DEHA（0.087和18.2 mg/kg饲料）15周。
- 组织学与生化检测：H&E染色、Oil Red O染色评估肝脏脂质沉积；血清生化分析（ALT/AST、血脂）检测肝损伤和代谢指标。
- 非靶向代谢组学：肝脏组织超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS)分析差异代谢物，结合KEGG和HMDB数据库进行通路富集，并利用ChEA3预测转录因子。
- 基因与蛋白表达：实时定量PCR(RT-qPCR)检测PPARγ下游基因和ER应激标志物mRNA水平；Western blot分析BiP、PERK、EIF2α及其磷酸化蛋白。
- 体外细胞实验：AML12（小鼠肝细胞）和L02（人肝细胞，均来自ATCC）暴露DEHA，CCK-8检测细胞活力，Oil Red O染色定量脂质积累，并采用4-PBA抑制ER应激验证机制。
**研究结果**
**3.1 亚慢性DEHA暴露增加雌性小鼠体重和体脂**
通过15周膳食暴露发现，DEHA处理组小鼠体重、体重增长率及体脂百分比显著高于对照组，体脂从第10周开始明显分离。食物摄入量和体表温度无显著差异，表明体重增加源于代谢改变而非能量摄入或产热变化。
**3.2 亚慢性DEHA暴露破坏雌性小鼠葡萄糖和脂质代谢稳态**
DEHA暴露组空腹血糖显著升高（高剂量效应更明显）。血清脂质谱显示，虽然甘油三酯(TG)无显著变化，但总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均升高，低剂量组效应更突出。肝脏组织学分析显示，DEHA处理组肝体比降低，肝内TG含量升高，H&E染色和Oil Red O染色证实肝脏脂肪变性、肝细胞肥大、小叶炎症及肝活动评分(LAS)增加，同时血清ALT/AST水平升高，表明肝损伤。低剂量组还显著增加附睾白色脂肪(eWAT)和腹股沟白色脂肪(iWAT)的相对重量，并诱导iWAT脂肪细胞肥大。
**3.3 非靶向代谢组学揭示DEHA暴露诱导的代谢紊乱**
对肝脏组织进行非靶向代谢组学分析，主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示组间代谢谱显著分离。低剂量DEHA组鉴定出35个差异表达代谢物(DEMs)，主要富集于泛酸和辅酶A生物合成、戊糖磷酸途径、不饱和脂肪酸生物合成；高剂量组鉴定出26个DEMs，主要涉及精氨酸生物合成、视黄醇代谢、丙酮酸代谢和半乳糖代谢。两剂量共享14个DEMs，包括TG、花生四烯酸、肌基琥珀酸等，其中TG升高与肝脂质积累一致。转录因子分析预测PPARγ、DDIT3和ATF3为潜在上游调控因子。
**3.4 DEHA暴露激活小鼠肝脏PPARγ和ER应激相关基因**
RT-qPCR结果显示，高剂量DEHA显著上调脂肪生成基因（Fasn、Mogat2、Dgat2、Scd1），低剂量亦诱导Dgat2和Scd1。PPARγ下游靶基因Cd36、Fatp4、Fabp4表达上调。ER应激标志物Grp78、Xbp1、Chop在低剂量组显著升高，Chop在高剂量组也升高，提示非单调剂量-反应关系。
**3.5 DEHA诱导肝细胞脂质积累**
体外实验显示，AML12和L02细胞在DEHA（3~3000 nM）暴露24 h后，细胞活力无显著变化，但Oil Red O染色显示剂量依赖性脂质积累。基因表达分析表明，在AML12细胞中，Fasn在3、30、300 nM上调，Acc1在3、300 nM上调，Acly和Scd1在3000 nM上调；L02细胞中，300 nM DEHA上调ACC1、MOGAT2、DGAT2，3000 nM上调ACLY和SCD1，说明DEHA直接刺激肝脏脂质从头合成。
**3.6 ER应激促进DEHA诱导的脂质积累**
使用ER应激抑制剂4-PBA预处理AML12细胞后，DEHA诱导的脂质积累显著减少，同时ER应激标志物（Chop、Grp78、Xbp1）和脂肪生成基因（Acc1、Acly、Scd1、Fasn）的表达被抑制。Western blot进一步证实DEHA暴露增加BiP蛋白表达，并增强PERK和EIF2α的磷酸化，表明UPR通路激活。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次在雌性小鼠模型中证实环境相关剂量DEHA通过激活PPARγ通路和诱导ER应激导致肥胖和肝脂肪变性，且低剂量效应更显著，呈现非单调剂量-反应关系(NMDRCs)，这或与高剂量时解毒路径饱和或相反信号通路激活有关。研究还提示雌激素信号与PPARγ的交互作用可能放大女性对DEHA的敏感性。同时，研究承认局限性：仅使用雌性模型，未包括雄性对比；非靶向代谢组学分辨率有限；仅关注膳食暴露途径，未涵盖多途径联合暴露；ER应激研究仅涉及UPR部分分支。
**结论翻译**：综上所述，研究人员的发现验证了原始假设，即环境相关膳食暴露于DEHA会诱导代谢紊乱，激活PPARγ信号通路，触发内质网(ER)应激，并最终导致雌性小鼠肝脂肪变性。这些结果通过使用小鼠和人肝细胞的体外实验得到进一步验证，从而增强了潜在分子机制的可靠性。这些发现填补了关于低剂量DEHA在女性中代谢毒性的知识空白，挑战了DEHA是安全增塑剂的传统观点，并强调了长期膳食暴露于DEHA的潜在健康风险。本研究为重新评估DEHA安全性提供了重要实验证据，并支持制定针对特定暴露途径的增塑剂监管政策。
