《Ecotoxicology and Environmental Safety》：CEBPB as a candidate mediator of DEGDB-induced tumor-associated phenotypes in colorectal cancer cells
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本研究旨在初步探讨新兴增塑剂二甘醇二苯甲酸酯（diethylene glycol dibenzoate，DEGDB）影响结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞恶性表型的机制，以支持对其潜在结直肠毒性和长期健康风险的评估。研究首先通过网络毒理
本研究旨在初步探讨新兴增塑剂二甘醇二苯甲酸酯（diethylene glycol dibenzoate，DEGDB）影响结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞恶性表型的机制，以支持对其潜在结直肠毒性和长期健康风险的评估。研究首先通过网络毒理学分析识别与DEGDB相关的CRC候选基因，随后通过表达验证优先选择CEBPB进行深入研究。进一步整合单细胞转录组数据，鉴定出肿瘤来源的上皮细胞中CEBPB表达高于正常来源上皮细胞。体外实验证实，CEBPB至少部分介导了DEGDB诱导的CRC细胞增殖、集落形成和迁移增强。最后，采用Kaplan?Meier生存分析评估早期结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）患者中CEBPB表达与预后的关联，并通过分子对接模拟预测DEGDB与CEBPB或其他候选蛋白之间的潜在结合模式。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例近190万例，且发病年龄呈明显年轻化趋势。除遗传易感性外，环境暴露对CRC发生发展的潜在贡献近年来受到越来越多的关注。增塑剂被广泛用于消费品和医疗器械以改善塑料聚合物的加工性能。由于传统邻苯二甲酸酯类增塑剂如邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP）被证实具有内分泌干扰效应和潜在致癌性，以二甘醇二苯甲酸酯（diethylene glycol dibenzoate, DEGDB）为代表的新兴增塑剂因其较低的急性毒性而逐渐被用作主要替代品。然而，DEGDB可从塑料基质中迁移到环境介质中。肠道既是口服异源物质的主要接触部位，也是维持代谢和黏膜免疫稳态的重要屏障。因此，长期或反复摄入DEGDB可能影响局部肠道和全身的生物过程。尽管DEGDB的使用日益扩大，但其环境分布、人体内暴露水平及长期健康效应尚未被系统表征。环境监测研究已在室内灰尘中检测到DEGDB，提示可能通过灰尘摄入、手口接触等途径暴露。DEGDB的分子结构含有苯甲酸酯基团，而长期过量摄入苯甲酸可能引起肝毒性和急性或慢性溶血，并通过诱导基因突变发挥潜在致癌效应。因此，本研究旨在初步探究DEGDB影响CRC细胞恶性表型的机制，为其潜在结直肠毒性和长期健康风险评估提供依据。该论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。
**主要技术方法**
研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）网络毒理学分析：利用PubChem、SwissADME、ADMETlab和ProTox 3.0预测DEGDB的理化性质、药物相似性、吸收分布代谢排泄毒性（ADMET）属性及毒理学终点；通过CTD（Comparative Toxicogenomics Database）、STITCH（Search Tool for Interactions of Chemicals）和SwissTargetPrediction筛选DEGDB相关靶点，并整合CRC差异表达基因（来自GSE39582和GSE44076数据集）获得候选基因。2）单细胞转录组分析：基于GSE132465数据集（23例原发肿瘤样本和10例匹配正常黏膜样本），分析CEBPB在肿瘤上皮细胞中的表达异质性，并利用伪时间轨迹和细胞间通讯分析（CellChat）探究其功能。3）体外功能实验：在HCT116和SW620细胞中，通过CCK?8、集落形成、Transwell迁移和伤口愈合实验评估DEGDB对细胞增殖、集落形成和迁移的影响，并通过小干扰RNA（siRNA）敲低CEBPB验证其介导作用。4）分子对接：使用AutoDock Vina预测DEGDB与候选蛋白的结合模式。5）临床预后分析：基于TCGA-COAD队列（The Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma）的转录组和临床数据，采用Kaplan?Meier生存分析评估CEBPB表达与早期COAD患者总生存期的关联。
**研究结果**
**3.1 DEGDB的毒理学特征及CRC相关候选基因的鉴定与验证**
研究人员首先整合PubChem、SwissADME和ADMETlab 3.0评估DEGDB的化学结构、理化性质和预测毒理学特征。毒理学预测显示DEGDB对眼刺激、致癌性和皮肤致敏性呈阳性结果，预测概率分别为0.860、0.840和0.709。通过CTD、STITCH和SwissTargetPrediction，经物种限制、标准化和去重后获得35个DEGDB相关候选基因。同时，在GSE39582和GSE44076数据集中进行差异表达分析，分别鉴定出2466和1419个差异表达基因，取交集后得到908个肿瘤相关基因。将908个肿瘤相关基因与35个DEGDB相关基因取交集，获得5个候选基因：CEBPB、SCD、DGAT2、IGF2和PPARG。基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析显示，这些基因富集于脂质稳态和细胞分化相关生物学过程，以及过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）信号通路等。经qRT?PCR验证，在DEGDB处理后，HCT116和SW620细胞中CEBPB mRNA表达均上调且变化倍数最大，因此优先选择CEBPB进行后续研究。
**3.2 单细胞转录组分析揭示CRC肿瘤上皮细胞中CEBPB表达升高**
基于GSE132465数据集的单细胞表达矩阵和细胞类型注释，所有细胞分为6个主要群体：上皮细胞、基质细胞、髓系细胞、T细胞、B细胞和肥大细胞。CEBPB表达显示显著异质性。与正常来源上皮细胞相比，肿瘤来源上皮细胞中CEBPB表达显著升高（P<0.0001）。由于CRC主要起源于结直肠黏膜上皮，后续分析聚焦于上皮细胞群体。对CEBPB在上皮细胞中的共表达基因进行GO和KEGG富集分析，发现显著富集于细胞-细胞连接组织、紧密连接组装和细胞黏附分子相关通路。
**3.3 肿瘤上皮细胞中的细胞间通讯、伪时间演变及CEBPB相关调控网络**
CellChat分析显示上皮细胞与髓系细胞、基质细胞等之间存在广泛通讯。伪时间轨迹重建表明，正常来源和肿瘤来源上皮细胞的伪时间分布存在显著差异，且CEBPB表达沿伪时间轨迹逐渐增加。以状态4（正常来源细胞比例最高）为起点，伪时间分析显示CEBPB表达随伪时间进程上调。构建以CEBPB为中心的基因调控网络，并通过计算机模拟敲除（in silico perturbation）发现，CEBPB扰动后，下游候选靶基因A1CF、A2ML1和A4GALT的表达变化显著，功能富集于维甲酸代谢过程、二萜代谢过程和脂质代谢过程。
**3.4 CEBPB在DEGDB诱导的CRC细胞恶性表型中的作用**
Western blotting显示DEGDB处理后HCT116和SW620细胞中CEBPB蛋白表达显著升高。CCK?8实验表明DEGDB处理组吸光度随时间增加，集落形成实验显示DEGDB处理组集落数量增多，Transwell迁移和伤口愈合实验均证实DEGDB显著增强细胞迁移能力（P<0.001）。通过siRNA敲低CEBPB（siCEBPB?1和siCEBPB?2）后，在DEGDB处理条件下，CCK?8吸光度降低、集落形成数量减少、迁移细胞数减少、伤口愈合率降低，表明CEBPB至少部分介导了DEGDB诱导的CRC细胞增殖、集落形成和迁移增强。
**3.5 CEBPB在早期COAD中的预后价值及DEGDB与候选蛋白的分子对接**
从TCGA-COAD中选取238例病理分期I或II期的COAD患者，Kaplan?Meier生存分析显示高CEBPB表达组总生存期显著短于低表达组。分子对接预测DEGDB与CEBPB的结合能为-6.6 kcal/mol，涉及Tyr274、Lys275、Arg278和Asn282等残基；与DGAT2、IGF2、PPARG和SCD的预测结合能分别为-5.8、-5.0、-5.7和-6.2 kcal/mol。
**讨论部分总结与结论翻译**
**讨论部分总结**：由于新兴增塑剂DEGDB对CRC细胞肿瘤相关表型的影响及潜在分子机制尚不清楚，本研究整合网络毒理学、单细胞RNA测序分析和RT?qPCR验证，优先选择转录因子CEBPB作为DEGDB相关候选调节因子。在测试浓度和暴露时间范围内，DEGDB显著增强CRC细胞增殖、集落形成和迁移，提示其可能促进CRC细胞恶性进展相关表型。方法学优势在于应用单细胞水平的计算机模拟扰动分析进行候选调节因子的优先选择和机制推断。模拟敲除提示CEBPB扰动可改变CRC相关细胞的转录调控网络。用两种独立siRNA敲低CEBPB可显著降低DEGDB诱导的增殖、集落形成以及Transwell迁移和伤口愈合，表明CEBPB参与并部分介导DEGDB诱导的肿瘤相关表型。这些发现可能具有公共卫生和转化医学意义：从公共卫生角度，为研究DEGDB的潜在胃肠道效应提供了实验支持；从转化角度，早期TCGA-COAD队列的探索性分析显示高CEBPB表达与较短总生存期相关。本研究的重要局限性在于当前机制证据主要来自体外细胞模型，无法完全捕捉DEGDB在体内的吸收、分布、代谢和组织特异性效应。未来研究应整合毒代动力学和组织分布分析、动物实验、环境暴露组学方法和前瞻性队列研究，以系统评估DEGDB的长期健康效应及DEGDB暴露与CRC风险的潜在关联。总之，本研究提供了DEGDB对CRC细胞肿瘤相关表型影响及潜在机制的初步实验证据，表明CEBPB可能部分介导这些效应，但人体DEGDB暴露特征、体内生物学效应及潜在健康风险需要动物实验、人体生物监测和流行病学研究进一步验证。
**结论翻译**：在本研究使用的体外暴露条件下，DEGDB促进了CRC细胞增殖、集落形成和迁移，而CEBPB敲低显著减弱了这些效应，提示CEBPB可能参与并部分介导DEGDB诱导的肿瘤相关表型。这些发现为评估DEGDB的潜在胃肠道生物学效应及相关分子机制提供了初步实验证据，并确定了未来机制研究和环境相关CRC人群风险评估的候选分子调节因子。
