《Food Bioscience》：Metatranscriptomics and RNA-Based amplicon sequencing in food research: advancing the understanding of active food microbiomes
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摘要高通量测序技术的进步彻底改变了生命科学研究。在食品相关研究中，宏转录组学 (MT) 和基于 RNA 的扩增子测序 (RAS) 应运而生，成为活性微生物组分析的基本工具，提供了超越传统基于 DNA 方法的微生物活性和功能见解。这些方法提供了对微生物活性、基因表达和代谢功能的
摘要
高通量测序技术的进步彻底改变了生命科学研究。在食品相关研究中，宏转录组学 (MT) 和基于 RNA 的扩增子测序 (RAS) 应运而生，成为活性微生物组分析的基本工具，提供了超越传统基于 DNA 方法的微生物活性和功能见解。这些方法提供了对微生物活性、基因表达和代谢功能的更深入理解，这对于研究发酵食品、食品腐败、食源性病原体、农产品和商品以及功能食品等主题至关重要。然而，许多挑战依然存在，例如 RNA 稳定性、微生物富集、数据标准化和生物信息学困难等问题。为了解决这些挑战，本综述全面介绍了 MT 和 RAS 的原理和工作流程，概述了从样本处理和 RNA 提取到测序和生物信息学分析的关键步骤。最近的应用在食品微生物组研究中也得到了探讨，突出了最近关于发酵、食品腐败、食源性病原体和宿主 - 微生物组相互作用的研究。根据当前的命名框架，我们讨论了“宏转录分类学”作为基于 RAS 的活性微生物群分析的概念术语，同时保留 RAS 作为实用的方法学名称。总之，将 MT 和 RAS 与其他方法相结合，能够进行更准确、可重复和具有影响力的食品微生物组研究，为推进食品安全、质量和功能食品创新提供了巨大潜力。
引言
高通量测序 (HTS) 及相关计算技术的革命性进展深刻重塑了生命科学研究领域 (Slatko 等，2018 年)。在这些进展中，涉及对复杂微生物群落进行全面分析和理解的宏基因组学 (MG) 已成为一个快速发展的研究领域 (New & Brito, 2020)。MG 方法使研究人员能够彻底调查和解释各种环境中的微生物群落，如土壤、水生系统、营养丰富环境、极端栖息地和宿主微生物组 (Pavlopoulos 等，2023 年；Quince 等，2017 年)。其中许多研究属于食品科学范畴，可为微生物相互作用及其对食品安全、质量和营养的影响提供宝贵见解。本质上，以基因组 DNA (gDNA) 为中心的 MG 研究可以通过两种主要方法进行：针对总微生物 gDNA 的鸟枪法测序（通常直接称为 MG），或靶向基因聚合酶链式反应 (PCR) 扩增子测序，后者通常称为基于 DNA 的扩增子测序 (DAS) 或宏分类学。虽然扩增子测序在理论上可以靶向任何基因或 DNA 片段，但在实践中，这些研究主要集中在核糖体 RNA (rRNA) 位点上，因为这些位点适合通用引物设计和分类学分类 (Regueira-Iglesias 等，2023 年)。在这种情况下，DAS 的重点通常是细胞微生物基因组 DNA 内的 rRNA 位点，而不是在微生物核糖体内转录和功能化的 rRNA 分子 (Lundberg 等，2013 年；Quince 等，2017 年)。因此，基于 DNA 的方法（MG 和 DAS 均如此）在区分非活性、休眠和死亡微生物方面面临重大挑战，因为这些生理状态下的 DNA 变化相对于 RNA 较小 (Singer 等，2017 年)。这一局限性对准确识别复杂微生物组内的活性微生物及其相应的功能基因构成了技术挑战，特别是在微生物活性至关重要的食品相关研究中。
随着前沿不断推进，宏转录组学 (MT) 和基于 RNA 的扩增子测序 (RAS) 日益被视为食品研究中分析活性微生物组的基本技术 (Peng 等，2018 年；Yang 等，2020 年)。MT 侧重于分析样本中的所有 RNA 转录本，提供基因转录的综合视图，而 RAS 靶向微生物核糖体（或其他基因位点转录本）的 rRNA，以研究微生物组的分类组成和功能潜力。与传统侧重于对 gDNA 进行测序以揭示微生物组潜在遗传库的基于 DNA 的方法不同，这些 HTS 方法通过靶向 RNA 转录本来深入挖掘微生物的活性和功能方面。与传统的 MG 测序相比，MT 和 RAS 都包含了 RNA 稳定、提取、纯化和逆转录步骤，这些步骤取代了 DNA 提取和纯化步骤 (Han 等，2022 年；Ojala 等，2023 年)。因此，MT 和 RAS 不仅保留了 MG 在无培养方式下研究复杂微生物生态系统的基本分析能力，而且通过关注微生物活性和实时代谢功能，显著增强了研究深度。因此，MT 和 RAS 方法有可能将推断的遗传潜力和实际生化活性联系起来，使能够更具体地描绘食品基质和食品研究环境中的微生物组功能 (Butowski 等，2025 年)。最近，MT 和 RAS 分析在食品发酵 (Sangkaew 等，2023 年；Wen 等，2023 年)、食品商品 (Haveman 等，2021 年；Yap 等，2022 年)、废物管理 (Kumar 等，2022 年；P. Wang 等，2022 年)、腐败 (Holl 等，2019 年；Hultman 等，2020 年)、食源性病原体毒力和发病机制 (H. Wang 等，2022 年；Zhang 等，2018 年)、益生菌 (Peng 等，2023 年；Wang 等，2021 年)、益生元 (Thompson 等，2024 年) 和宿主肠道健康 (Westreich 等，2020 年；Zhang 等，2023 年) 的食品微生物组研究中被越来越多地使用 (图 1)。这些研究依赖于 RNA 介导的生物活性，可以通过全面的转录组分析探索来阐明。除了这些既定的应用领域外，MT 和 RAS 还可能支持与精密发酵、合成生物学、个性化营养、农食生物技术和生物基生产相关的新兴食品研究 (Butowski 等，2025 年；Ewing 等，2022 年；Hilgendorf 等，2024 年；Wehrs 等，2019 年) (图 1)。在这些情况下，基于 RNA 的方法可以帮助表征活性微生物分类群、表达功能、工程化通路以及与微生物组相关的代谢反应。因此，活性微生物组分析可能进一步将传统食品微生物学与更广泛的食品相关生物技术和生物系统联系起来。
尽管 MT 和 RAS 在食品相关研究中的认可度和采用率不断增长，但许多挑战依然存在，特别是那些与 RNA 保存和高完整性 RNA 提取相关的问题、分析准确性的局限性以及这些方法对不同研究环境的适应性。本综述批判性地探讨了 MT 和 RAS 在食品科学中的最新进展和创新应用，重点关注改进的分析方法及其在不同研究环境中的实际部署。通过综合关键发现和应用见解，我们旨在弥合创新与实践之间的差距，促进食品微生物组研究更准确、可重复和具有影响力的成果。
章节摘要
方法学概述
理论上，MT 和 RAS 可以提供复杂生态系统中微生物转录组的全景快照。重要的是，它们的分析准确性依赖于可靠的 RNA 稳定和提取技术，这些技术确保从样本中快速稳定、长期保存和纯化微生物 RNA (Y. Zhang 等，2021 年)。后续步骤对于有效分离目标微生物 RNA，将其与非目标 RNA、有机物分离同样关键，
发酵食品
发酵，作为一种永恒且不断演变的烹饪传统，长期以来一直被认为是一种不可或缺的食品加工实践，通过这种实践，微生物深刻地塑造了人类营养、健康和食品文化 (Galimberti 等，2021 年)。发酵食品可以通过自发发酵或接种发酵生产，这取决于是否向食品基质中添加发酵剂 (Capozzi 等，2017 年)。值得注意的是，现代微生物工业
腐败与病原体
食品腐败和食源性疾病是食品供应链中的主要挑战，导致重大的公共卫生风险和经济成本。腐败微生物，如 假单胞菌属 (Pseudomonas)、光杆菌属 (Photobacterium) 和 希瓦氏菌属 (Shewanella)，可以在各种食品基质和环境条件下繁衍，导致食品质量下降 (表 2) (Odeyemi 等，2020 年)。它们的代谢活动有助于产生不良化合物，如异味、毒素和结构
生鲜农产品和食品商品
生鲜农产品和食品农业商品，如水果、蔬菜、叶菜等，是全球食品供应链的重要组成部分。这些产品自然宿主多样化的微生物群落，包括病毒、细菌、酵母和霉菌，这些显著影响食品质量和安全 (表 3)。特别是在病毒学研究中，MG 和 MT 都已成为分析 DNA 和 RNA 病毒广泛存在的强大方法 (
功能食品与宿主微生物组
食品的功能方面已成为一个广泛讨论的话题，特别是与益生菌、益生元、合生元和其他生物活性食品成分相关 (表 4) (Han 等，2024 年)。在这些研究中，宿主微生物组是中心焦点，鉴于其在食品、营养和人类健康之间错综复杂的联系。为了阐明饮食与肠道微生物群之间的复杂相互作用，MT 和 RAS 已成为强大的工具。这些方法使研究人员能够破译
挑战与未来展望
MT 和 RAS 的兴起正在改变微生物组研究，提供前所未有的微生物活性和功能见解，同时也带来了新的方法论和解释性挑战。虽然 MT 和 RAS 在食品相关研究中应用日益广泛，但食品样本的多样性、RNA 快速降解、微生物富集的困难以及缺乏成熟的数据库和方案等问题，提出了重大挑战，可能会损害
CRediT 作者贡献声明
杨少清: 写作 – 评论与编辑，概念化。 韩东: 写作 – 评论与编辑，写作 – 初稿，可视化，软件，概念化。 江征强: 写作 – 评论与编辑，监督，项目管理。 王彦波: 写作 – 评论与编辑。 李元杰: 写作 – 评论与编辑。 陈俊波: 写作 – 评论与编辑，验证
未引用参考文献
Wang 等，2022 年；Zaccaria 等，2023 年；Zhang 等，2021 年。
关于在稿件准备过程中使用生成式 AI 及 AI 辅助技术的声明
图 1、图 2、图 3 中的解释性图形元素是使用 OpenAI ChatGPT Images 2.0 (GPT Image 2，访问于 2026 年 6 月) 进行优化的。作者审查并验证了所有最终图形内容，并对出版作品承担全部责任。
基金
作者感谢 国家自然科学基金 项目 (No. 32472352) 的资金支持。
Dong Han|Shaoqing Yang|Junbo Chen|Yuanjie Li|Yanbo Wang|Zhengqiang Jiang
食品生物工程技术重点实验室（中国轻工业），中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京，100083，中国
