市售部分水解及深度水解婴儿配方奶粉中的残留致敏性：一项结合免疫学与质谱法的研究

《Food Chemistry》：Residual allergenicity in commercial partially and extensively hydrolyzed infant formulas: A combined immunological and mass spectrometric study

　　

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  整合免疫学和肽组学评估配方的残留过敏性。
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  市售部分水解配方在残留过敏性方面表现出异质性。
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  特定的β-乳球蛋白表位在深度水解配方中持续存在。
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  水解度不能线性预测 IgE 结合能力。
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  表位水平分析对于特殊医学用途配方食品的安全性评估至关重要。

引言

牛奶蛋白过敏（CMA）是幼儿期最常见的食物过敏之一，通常发生在出生后的第一年。流行病学研究报告称，发达国家约 2–7% 的婴儿对牛奶蛋白过敏（Mousan & Kamat, 2016），而中国婴儿的横断前瞻性调查基于开放式口服食物激发试验报告的患病率为 2.7%（Yang et al., 2019）。CMA 在临床上定义为对牛奶蛋白（通常是酪蛋白或乳清蛋白）的可重复不良反应，由复杂的免疫机制介导。乳清蛋白组分（占牛奶总蛋白的 20%）包含β-乳球蛋白（BLG）、α-乳白蛋白（ALA）和牛血清白蛋白（BSA）。值得注意的是，BLG 被认定为主要过敏原成分，约 75% 的 CMA 病例表现出对 BLG 的 IgE 反应性，凸显了其在 CMA 诊断和管理中的临床意义（Monaci et al., 2006）。

CMA 的管理主要依赖于严格饮食去除牛奶蛋白。国际指南一致建议继续母乳喂养作为 CMA 婴儿的最佳营养来源（Jensen et al., 2022）。当母乳喂养不可行或不足时，深度水解婴儿配方（EHF）被批准为首选替代品（Fleischer et al., 2013）。美国儿科学会将 EHF 定义为含有分子量（MW）主要低于 3 kDa 的肽和氨基酸的配方，这能有效缓解超过 90% 的 CMA 病例症状，仅报道了偶发的过敏反应（Committee on Nutrition, 2000）。EHF 通常通过酶解和牛奶蛋白热处理生产，旨在大幅降低或消除过敏性（Nutten et al., 2020）。相比之下，部分水解配方（PHF）含有大量分子量在 3–10 kDa 范围内的肽，通常不建议用于确诊 CMA 的婴儿，因为它们保留了免疫原性（Nutten, 2016）。然而，新兴证据表明，某些 PHF 产品可能被一些轻度至中度 IgE 介导的 CMA 婴儿耐受，表明它们在伴随持续风险的同时具有潜在效用（Chisato Inuo et al., 2019）。

PHF 和 EHF 产品之间存在显著的异质性，涉及残留过敏性，这归因于蛋白来源、酶促协议和水解度（DH）的差异（Nutten, et al., 2020）。欧洲食品安全局规定，每种基于蛋白水解物的配方的安全性和适用性必须通过临床研究来证实（EFSA Panel on Nutrition et al., 2025）。尽管对 EHF 的过敏反应被认为罕见，但临床研究和病例报告记录了食用后急性反应（包括过敏性休克）的实例。例如，（Petrus et al., 2015）观察到约 51% 的 CMA 儿童未能通过特定的 EHF 实现症状缓解。此外，许多市售 PHF 和 EHF 产品的残留过敏潜力——特别是在表位水平——的综合数据并未常规披露，这对临床风险评估和知情决策提出了挑战。

目前评估 PHF 和 EHF 产品残留过敏性的体外方法包括 DH 测定、MW 分布分析以及基于免疫学的测定，如 ELISA 和免疫印迹（Vandenplas et al., 2021）。虽然这些技术敏感且被广泛使用，但它们对肽序列和残留表位信息的洞察有限（Lambers et al., 2015）。DH 等全局参数无法捕捉表位特异性切割，且针对完整蛋白产生的基于抗体的测定可能检测到与人类 IgE 识别无关的表位。因此，中国市售 PHF 和 EHF 产品的系统表位水平分析数据仍然稀缺。基于质谱（MS）的肽组学的最新进展彻底改变了过敏原表位的检测和定量，为识别复杂水解物中的免疫反应性肽提供了高分辨率和准确性（Carrera et al., 2024）。这种方法允许精确绘制残留 T 细胞和 IgE 表位图谱，提供比传统方法更全面的 safety assessment（安全性评估）。

鉴于这些考虑，本研究旨在系统评估在中国注册为特殊医学用途配方食品（FSMP）的 PHF 和 EHF 产品的残留过敏性。我们结合了传统分析技术——包括 DH、SDS-PAGE、IgE 结合 ELISA 和 SEC——与高分辨质谱（HRMS），以对五种 PHF 和三种 EHF 产品进行多维表征。此外，我们使用基于专利信息和实验室优化的两步酶促工艺制备了实验室规模的深度水解乳清蛋白水解物（WPH），以便与商业 EHF 进行对比分析，旨在检查商业产品中观察到的持续表位区域在确定的水解条件下是否仍然保持抗性。通过结合传统测定与基于 MS 的表位图谱，本研究旨在表征商业水解配方中的残留表位图谱，并为评估残留过敏性提供补充信息。

部分摘要

试剂和材料

PHF 和 EHF 样品（均在中国注册为 FSMP）通过授权的在线和离线零售渠道购买。乳清蛋白浓缩物 -80（WPC 80）由 Friesland Campina（荷兰）提供。商业酶包括 Alcalase? 2.4 L, Neutrase? 0.8 L, Flavourzyme? 500 MG, 和 Protamex? 1.5 L 从 Novozymes（丹麦）购买。RIDASCREEN? β-乳球蛋白（BLG）ELISA 试剂盒（货号 R4901）从 R-Biopharm AG（德国达姆施塔特）购买。辣根

SDS-PAGE 和 Tricine-SDS-PAGE 分析

水解婴儿配方中蛋白和肽的 MW 分布是评估水解程度和残留过敏性的重要参数（Galv?o et al., 2001）。图 1 展示了不同 PHF 和 EHF 样品的电泳图谱。在 PHF 组（图 1a）中，SDS-PAGE 图谱显示主要过敏原蛋白，即，BLG（18.8 kDa）和 ALA（14.4 kDa），被部分水解，生成较小的肽。然而，完整过敏原的条带

结论

总之，本研究结合了 DH 测定、MW 图谱、IgE 结合测定和 HRMS 来评估商业 PHF 和 EHF 产品的残留过敏性。我们的发现表明，大于 1200 Da 的肽比例和残留 BLG 含量可作为水解配方中残留过敏潜力的有用指标。基于 HRMS 的表位图谱进一步揭示，特定的 BLG 来源表位区域即使在深度

CRediT 作者贡献声明

Qiaozhi Zhang: 撰写 – 审阅与编辑，验证，形式分析，概念化。 Feiyang Huang: 撰写 – 原始草稿，调查，形式分析。 Aiqian Ye: 监督，资源。 Jian He: 监督，资源。 Sufang Duan: 监督，项目管理。 Yalu Yan: 验证，资源。 Huadong Sheng: 验证，资源。 Zhongshan Gao: 监督，方法论。 Hua Huang: 撰写 – 审阅与编辑，验证，资源。 Linglin Fu: 撰写 – 审阅与编辑，

未引用参考文献

Mousan and Kamat, 2016

Nutten et al., 2020

Nutten, Schuh, Dutter, Heine and Kuslys, 2020

Yi, Lin and Johns, 2021

竞争利益声明

作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能被认为影响了本论文中报告的工作。

致谢

本研究由国家市场监督管理总局科技项目资助（No. 2024MK056），浙江省市场监督管理局“鹰计划”培养项目（No.CY2023005, Q.Z.Z.），国家乳品技术创新中心开放项目及呼和浩特科技计划（No. 2024-KFKT-009, L.L.F.; 2022-Ke Yan Gong Guan-No. 4 Project, Y.L.Y.），以及“健兵 & 领雁 + X"科技项目

知情同意和患者详情

已获得所有参与者或其法定代表人的书面知情同意，以参与研究并发布文章。已尊重参与者的隐私权。

人体和生物材料

本研究包含器官或组织捐献者。本研究包含人类生物材料，并已获得捐献者、其直系亲属或法定代表人的同意，用于本研究并发布文章。本研究中使用的样本未来源于被处决的囚犯或良心犯。

人体研究

本研究在研究进行地点的相关法律、监管框架和指南的指导下执行。本研究已获中国科学技术大学附属第一医院批准。（批准号 2021-KY-233）。

Qiaozhi Zhang|Feiyang Huang|Aiqian Ye|Jian He|Sufang Duan|Yalu Yan|Huadong Sheng|Zhongshan Gao|Hua Huang|Linglin Fu