通过祖先序列重建技术工程化耐热亚胺还原酶，实现一锅法化学酶促合成 (S)-尼古丁

《Food Bioscience》：Engineering a thermostable imine reductase through ancestral sequence reconstruction enables one-pot chemoenzymatic synthesis of ( S)-nicotine

　　

摘要

尼古丁作为一种重要的生物碱，广泛应用于医药、杀虫剂、电子烟及类似食品的口用递送制剂中。传统生产主要依赖植物提取和化学合成，存在依赖农业资源、纯化程序复杂、立体化学控制差以及环境负担重等局限性。涉及亚胺还原酶（IRED）催化和化学甲基化的化学酶法合成作为一种可持续的替代方案应运而生，但热不稳定的酶与下游化学转化所需高温之间固有的不兼容性，仍然是开发高效一锅法化学酶法工艺的主要障碍。在本研究中，使用祖先序列重建（ASR）技术从 MfIR 中生成了高热稳定的祖先支架 anc157，随后通过结构导向工程鉴定出具有高热稳定性和催化活性的组合突变体 anc157-M178V/F209V/A216V（anc157-M3）。与 MfIR 相比，最优反应温度达到 55 ^oC 的 Anc157-M3 表现出 7.99 倍的催化活性提升、24.56 °C 的熔变温度增加以及 142.1 倍的热半衰期延长。分子动力学模拟揭示，祖先重建在全球范围内增强了结构刚性。在优化条件下，anc157-M3 仅在 15 分钟内即以 70% 的产率和 >99% ee 实现了 (S)-去甲尼古丁的制备合成，并进一步成功地在 80 ^oC 下仅在 2 小时内实现了从肌碱出发制备 (S)-尼古丁的一锅法一步化学酶法合成（0.61 g/L），ee >99%。这项工作通过蛋白质热稳定性工程，确立了克服酶催化和化学催化之间长期不兼容性的有效策略，为开发集成化学酶法工艺以可持续合成高价值化学品提供了通用平台。

引言

尼古丁是一种天然存在于茄科植物中的吡啶型生物碱，主要存在于烟草（Nicotiana tabacum）中 (Shitan et al., 2009; Shoji et al., 2010)。自 1690 年首次记录作为农药用于农业以来，尼古丁一直被认为是自然界中最强的杀虫生物碱之一 (Troczka et al., 2021; Walia et al., 2017; Xiao et al., 2022)。除了其在植物中已确立的防御作用外，尼古丁通过作用于烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）发挥多种药理活性，包括抗炎特性 (Lakhan & Kirchgessner, 2011; Piao et al., 2009; Zhang et al., 2022)、缓解急性和慢性疼痛 (Ditre et al., 2016; Mannelli et al., 2013; Teng et al., 2019)，以及通过激活 α7-nAChR 通路发挥神经保护作用，表现出对阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的治疗潜力 (Quik, 2004; Quik et al., 2007; Quik et al., 2012; Young et al., 2004)。除了这些医药应用外，尼古丁作为减害产品电子烟尼古丁递送系统的主要成分，以及用于尼古丁替代疗法的类似食品的口用递送制剂（如药用口香糖和含片）的成分 (Hajek et al., 2019; Hartmann-Boyce et al., 2018; Stead et al., 2012)，推动了数十亿美元市场的持续工业需求 (Diaz et al., 2025; Jackler & Ramamurthi, 2019; Silver et al., 2026; Trigger et al., 2023)。这种药用价值和经济意义的交汇确立了尼古丁作为一种具有持久重要的高价值生物碱的地位。

传统上，工业尼古丁生产依赖于从烟草叶中进行溶剂提取，这取决于农业种植，易受气候变异和土地使用限制的影响。此外，烟草叶中尼古丁含量低（占干叶重量高达 3.0%）(Yuan, 2020) 以及消除其他相关生物碱和植物次生代谢物所需的昂贵下游纯化，进一步限制了其在高端医药场景中的应用。化学全合成虽然不依赖于植物生物量，但通常涉及需要多种化学催化剂、手性拆分或不对称合成以获得对映体纯度的复杂多步路线，并产生大量有机废物。尽管生物合成代表了一种更环境友好且具有立体选择性的替代方案 (Zhang et al., 2026b)，但其发展长期以来一直受到尼古丁生物合成途径阐明不完全的阻碍，该途径直到最近几年才完全被解码 (Chang et al., 2026; Schwabe et al., 2026)。

化学酶法合成 (Chakrabarty et al., 2021; Liu et al., 2026a; Liu et al., 2026b; Yuan et al., 2026a; Yuan et al., 2026b; Zhu et al., 2023; Zhu et al., 2025) 结合了生物催化的精美立体选择性和化学合成的灵活性，作为一种有望根据绿色化学原则高效生产对映体纯尼古丁的替代方案应运而生 (McCague & Narasimhan, 2021)。然而，该策略目前受限于关键酶较差的热稳定性，无法承受下游化学反应所需的高温。具体而言，由亚胺还原酶（IRED）催化的肌碱向 (S)-去甲尼古丁的生物催化还原 (Aleku, 2024; France et al., 2016; Mangas-Sanchez et al., 2017; Schober et al., 2019; Thorpe et al., 2022; Zhang et al., 2025) 必须在温和条件下进行，这与随后需要在约 80 ^oC 温度下进行有效还原性 N-甲基化以产生 (S)-尼古丁的埃施韦勒 - 克拉克（Eschweiler–Clarke）甲基化步骤不兼容（图 1A）。因此，化学和酶促反应必须分开并顺序进行，这不仅增加了合成步骤的数量和操作复杂性，而且限制了该方法的工业竞争力。

为了解决这一困境，祖先序列重建（ASR）(Deng et al., 2025; Gumulya & Gillam, 2017; Prakinee et al., 2024; Sun et al., 2024; Wang et al., 2026; Yang et al., 2025; Zhu et al., 2024) 是一种强大的方法，可从现代同源物中检索古代酶变体以获得具有增强热稳定性的稳健生物催化剂，可能是一个有前景的策略。我们假设恢复目标酶的祖先序列将在不损害其催化活性和立体选择性的情况下显著提高其热稳定性，使其能够承受化学步骤所需的 80 ^oC 反应条件。在此，我们进行了 ASR 以挖掘一种祖先亚胺还原酶，并在结构导向的合理工程后提高了其活性，获得了突变体 anc157-M178V/F209V/A216V（anc157-M3），与亲本酶 MfIR (Hughes, 2022) 相比，其热稳定性（ΔT_m = 24.56 ^oC）和催化活性（7.99 倍）显著增强（图 1B）。此外，制备级反应仅需 15 分钟即可生产出 70% 产率、>99% ee（对映体过量值）的 (S)-去甲尼古丁，从肌碱出发制备 (S)-尼古丁的一锅法一步化学酶法反应在 80 ^oC 下仅需 2 小时即可实现 0.61 g/L 产率，ee >99%，从而消除了中间后处理的需要，提高了整体过程的步骤经济性和操作简便性。这项工作不仅为简化 (S)-尼古丁的工业化学酶法生产提供了稳健的生物催化剂，还提供了克服高价值天然产物化学酶法合成中热稳定性瓶颈的通用策略。

章节摘要

菌株、质粒和试剂

编码 MfIR 的质粒由仪信生物（上海）合成，并克隆到 pET-21b 表达载体中。Escherichia coli TOP10 用于质粒扩增，而 E. coli BL21(DE3) 作为表达宿主（表 S1）。用于诱变的引物由仪信生物（中国上海）合成和测序（表 S2）。底物肌碱购自蕾安试剂（中国上海）。异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、咪唑，

热稳定祖先亚胺还原酶的挖掘与筛选

开发 (S)-尼古丁合成的一锅法一步化学酶法路线的主要障碍在于天然 IRED 的热稳定性差，无法承受后续埃施韦勒 - 克拉克甲基化所需的高温（约 80 ^oC）。为了克服这种固有的温度不匹配，采用了一种强大高效的策略，即祖先序列重建，以识别在潜在保持催化活性下具有热稳定性的 IRED 支架

结论

在本研究中，我们开发了一种有效的蛋白质工程策略，以克服亚胺还原酶固有的热稳定性限制，用于高温化学酶法合成。通过整合 ASR 与结构导向的活性位点工程，我们成功地将中温 IRED MfIR 转变为一种稳健的生物催化剂，能够在随后埃施韦勒 - 克拉克甲基化反应所需的条件下运行。工程变异体 anc157-M3 同时表现出

CRediT 作者贡献声明

Yan Zhang: 概念化。Yijian Rao: 写作 – 审查与编辑，资金获取，概念化。Zhenbo Yuan: 写作 – 审查与编辑，写作 – 原稿撰写，监督，资金获取，概念化。Luyun Ji: 写作 – 原稿撰写，方法学，调查。Guangyao Li: 方法学，调查。Yuhao Zhuang: 方法学，调查。Xiaorui Chen: 形式分析。Zhiwei Deng: 软件。Changmei Liu: 形式分析。Zhengshan Luo: 形式分析

竞争利益声明

作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能看起来影响了本论文报告的工作。

数据可用性

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竞争利益声明

? 作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能看起来影响了本论文报告的工作。

致谢

本研究由 国家自然科学基金委员会（22477047 和 32270082）以及 中央高校 基本科研业务费专项资金（JUSRP202603037 和 JUSRP202404012）资助。

Luyun Ji|Guangyao Li|Yuhao Zhuang|Xiaorui Chen|Zhiwei Deng|Changmei Liu|Zhengshan Luo|Yan Zhang|Yijian Rao|Zhenbo Yuan

教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院，中国，无锡，214122