不同功能微生物发酵番荔枝果汁的理化性质、功能活性和代谢组学比较分析

《Food Chemistry: X》：Comparative analysis of physicochemical properties, functional activities, and metabolomics of Annona squamosa juice fermented by different functional microorganisms

　　

番荔枝（Annona squamosa）是一种热带水果，具有独特风味但采后易腐烂。本研究评估了用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、热带醋酸菌（Acetobacter tropicalis）、罗伊氏柠檬酸杆菌（Limosilactobacillus reuteri）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）发酵对果汁特性的影响。发酵增加了总酚、总黄酮和游离氨基酸，并改善了口感。发酵果汁显示出增强的抗氧化、抗菌和抗炎活性，对α-淀粉酶（α-amylase）、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）和胰脂肪酶（pancreatic lipase）的抑制增加（p?**论文解读：不同功能微生物发酵番荔枝果汁的理化性质、功能活性与代谢组学比较分析**

**研究背景与意义**

番荔枝（*Annona squamosa*）是一种热带水果，以其独特风味和丰富营养著称，富含酚类化合物、生物碱和番荔枝内酯等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎和抗菌等潜在健康功效。然而，该果实采后呼吸速率高，成熟迅速，导致软化腐烂，贮藏稳定性差，货架期短。目前，其利用主要局限于鲜食，加工产品少，深加工技术落后，限制了产业增值。因此，开发新型加工策略以提升番荔枝的利用效率和附加值，对产业可持续发展至关重要。近年来，消费者对健康食品的需求推动功能性发酵饮料市场快速增长。植物基发酵饮料因无乳糖、适合素食者和特定饮食需求人群而具有优势。水果因富含可发酵糖、维生素、矿物质和抗氧化剂，是理想的发酵基质。番荔枝因糖含量高、pH适中，特别适合发酵。乳酸发酵已被广泛认可为改善水果制品功能特性的有效策略。不同微生物菌株在水果发酵体系中表现出不同的代谢能力：枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）能产生水解酶促进底物降解；热带醋酸菌（*Acetobacter tropicalis*）可将乙醇氧化为乙酸，改善风味；罗伊氏柠檬酸杆菌（*Limosilactobacillus reuteri*）和布氏乳杆菌（*Lactobacillus buchneri*）分别具有益生调节功能和对植物基基质的适应性。然而，不同微生物在同一水果基质中诱发何种代谢响应，以及如何影响终产品的营养组成和功能特性，仍需系统研究。本研究旨在通过四种功能微生物发酵番荔枝果汁，系统考察不同菌株对果汁理化性质、功能活性、风味特征和代谢组学谱的影响，阐明微生物发酵的调控机制，为开发功能性发酵番荔枝饮料提供理论依据。该论文发表于《Food Chemistry: X》。

**主要关键技术方法**

研究人员从云南昆明当地市场采购成熟无损伤番荔枝果实，去皮去籽后匀浆、过滤、巴氏杀菌，得到果汁基质。所用四种菌株（枯草芽孢杆菌CCTCC AB 2025223、热带醋酸菌CCTCC AB 2026003、罗伊氏柠檬酸杆菌CCTCC AB 2026004、布氏乳杆菌CCTCC AB 2025224）均由研究组从蜂产品中分离并保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。接种前进行安全性评估（溶血试验和抗生素敏感性试验）。发酵条件为37°C、150 rpm、48小时，接种量5% (v/v)，初始菌密度约1.0×10⁷ CFU/mL。主要技术方法包括：pH计和数字折光仪测定pH和可溶性固形物；Folin–Ciocalteu法测总酚；NaNO₂–Al(NO₃)₃–NaOH比色法测总黄酮；茚三酮法测游离氨基酸；FRAP、羟基自由基、DPPH和ABTS法测抗氧化活性；酶抑制法测α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性；琼脂扩散法测抗菌活性；电子舌测味觉；非靶向代谢组学（LC-MS/MS）结合PCA、OPLS-DA及KEGG通路富集分析代谢物差异和通路。

**研究结果**

**3.1. 功能菌株的安全性评价**
通过溶血试验和抗生素敏感性试验发现，四种菌株均无溶血活性，且对多种抗生素（如氨苄西林、链霉素、阿米卡星等）表现出敏感性或中度敏感性，总体符合食品发酵安全要求。

**3.2. 发酵对番荔枝果汁中生物活性化合物的影响**
**3.2.1. pH和Brix变化**
所有发酵组pH持续下降，其中L. reuteri和L. buchneri组在0-16小时快速下降；B. subtilis和A. tropicalis组在中后期下降更明显。可溶性固形物（°Brix）在所有发酵组显著下降，B. subtilis组下降最显著，而L. reuteri、L. buchneri和A. tropicalis组在24小时后趋于稳定或略有回升，表明菌株碳利用策略差异。

**3.2.2. 总酚、总黄酮和游离氨基酸**
总酚含量在发酵早期和中期显著增加（P<0.001），后期趋于稳定。总黄酮含量在L. buchneri组显著增加（从0.28±0.01到0.43±0.02 mg/mL，P<0.001），其他组先增后稳。游离氨基酸含量在发酵后期显著增加（P<0.001），表明微生物蛋白酶和肽酶活性增强。

**3.3. 发酵液体外活性**
**3.3.1. 体外抗氧化活性**
FRAP值在8-16小时显著增加，B. subtilis和L. buchneri组活性最高。羟基自由基清除活性各菌株表现不同，A. tropicalis、L. reuteri和L. buchneri组相对稳定。ABTS⁺清除能力随时间增加，A. tropicalis和L. reuteri组显著高于对照（P<0.001）。DPPH清除活性先增后降，中期达峰值。总体发酵显著增强抗氧化能力，主要归因于酚类和黄酮类化合物的释放与转化。

**3.3.2. 体外功能酶抑制活性**
α-淀粉酶抑制活性在L. reuteri和L. buchneri组发酵期间增加，B. subtilis和A. tropicalis组后期增强。α-葡萄糖苷酶抑制活性随时间增加，24小时达峰值，尤其A. tropicalis和L. buchneri组（P<0.001）。胰脂肪酶抑制活性呈菌株依赖性差异，B. subtilis组8小时达峰值后下降，其他组先降后升。黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制活性在所有组随时间持续增加，24小时达最大（P<0.001），抑制率接近阳性对照（87.07±5.31）%。蛋白质变性抑制活性在B. subtilis和A. tropicalis组16-24小时达峰值，乳酸菌组保持稳定。Fe²⁺螯合能力总体增加，L. reuteri组早期最强。

**3.3.3. 食源性病原菌抑制活性**
未接种对照（Nfa）表现出中等抑制效果，无菌水无活性。发酵后抗菌活性显著增强。B. subtilis组对大肠杆菌（*E. coli*）、肠炎沙门氏菌（*S. enteritidis*）和单核细胞增生李斯特菌（*L. monocytogenes*）抑制最强；L. reuteri组对金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）和肠炎沙门氏菌抑制强；L. buchneri组对单核细胞增生李斯特菌抑制显著；A. tropicalis组活性中等。抗生素敏感性分类显示，B. subtilis和L. reuteri组抗菌性能最强。

**3.4. 发酵番荔枝汁的味觉差异**
电子舌分析显示，所有发酵样品酸味（CAO）和苦味（COO）为主导，涩味（AE1）、鲜味（AAE）、甜味（GL1）和咸味（CT0）较低。与对照相比，发酵增加了酸味、甜味和鲜味，降低了苦味和涩味。主成分分析（PCA）显示PC1和PC2累计贡献93.1%，样品间区分明显。

**3.5. 非靶向代谢组学分析**
**3.5.1. 发酵液样品比较分析**
PCA显示发酵组与未发酵组明显分离，生物重复聚类良好，表明发酵显著重塑代谢谱。PLS-DA进一步区分各组，置换检验证实模型无过拟合。

**3.5.2. 发酵液代谢物统计**
共检测到12,563个正离子和8,995个负离子特征，注释到686个（KEGG）和1,757个（HMDB）代谢物。代谢物分类以有机酸及其衍生物、脂类和类脂分子为主。KEGG通路富集显示ABC转运蛋白、次生代谢物生物合成、抗坏血酸和醛酸代谢、氨基酰-tRNA生物合成、D-氨基酸代谢和类黄酮生物合成等通路显著富集。

**3.5.3. 差异代谢物分析**
聚类热图显示组内重复性高，组间差异显著。火山图显示各发酵组与对照相比有大量上调/下调代谢物。B. subtilis vs Nfa组中花青素和原儿茶酸显著上调，某些氨基酸二肽下调。A. tropicalis vs Nfa组中L-缬氨酸和色氨酸相关肽显著改变。L. reuteri vs Nfa组中γ-谷氨酰甲硫氨酸显著增加。L. buchneri vs Nfa组中氨基酸肽和酚类糖苷（如arg-pro二肽和锦葵色素-3-咖啡酰葡萄糖苷）显著上调。VIP得分显示埃博霉素A、花青素、原儿茶酸、γ-谷氨酰甲硫氨酸、尼嗪米宁A、异丙基-β-D-葡萄糖苷等显著上调。

**3.5.4. KEGG代谢通路分析**
各发酵组均显著影响ABC转运蛋白、核苷酸代谢、糖代谢、氨基酸代谢等核心通路。B. subtilis组还富集乙醛酸和二羧酸代谢；A. tropicalis组富集苯丙氨酸代谢和氨基酰-tRNA生物合成；L. reuteri组富集半乳糖代谢和嘌呤代谢；L. buchneri组富集苯丙烷生物合成和类黄酮生物合成。

**3.5.5. 关键代谢物与生物活性相关性分析**
Pearson相关分析显示，大多数酚类化合物、氨基酸衍生物和微生物代谢物与抗氧化能力、酶抑制活性和抗菌活性呈正相关。原儿茶酸、埃博霉素A、花青素、犬尿喹啉酸、胍丁胺和3-羟基黄酮与多种活性指标显著正相关（P<0.05）。D-山梨醇、L-苹果酸、Tyr-Met和(-)-表没食子儿茶素3-p-香豆酸酯与大多数功能参数负相关，但与酸味正相关。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究四种功能微生物发酵显著改变了番荔枝果汁的理化特性、代谢物组成、感官属性和体外生物活性，且表现出菌株依赖性差异。微生物安全性评估显示所选菌株无溶血活性，抗生素敏感性可接受。发酵通过有机酸积累、蛋白质水解、酚类释放等机制改善了风味和功能活性。其中，B. subtilis因强大胞外酶能力（蛋白酶、淀粉酶、多糖降解酶）增强底物降解和功能特性；A. tropicalis通过氧化代谢产生乙酸，改善酸度和风味；L. reuteri和L. buchneri则通过乳酸发酵和代谢重塑影响代谢物谱。相关分析表明，增强的活性与酚类化合物和氨基酸衍生物密切相关。埃博霉素A在多个发酵组中显著增加，但其实际浓度和生物学意义需进一步靶向定量和功能验证。总体而言，功能微生物发酵有效调控了番荔枝果汁的营养组成、代谢物谱、感官质量和体外生物活性，为其作为功能性发酵饮料的开发提供了实验支持。

**结论翻译**：
本研究探讨了四种功能微生物发酵对番荔枝果汁理化性质、体外生物活性、感官特性和代谢组学谱的影响。发酵使总酚含量显著增加（1.5–2.2倍），并增强了体外抗氧化、抗菌和酶抑制活性。非靶向代谢组学揭示了菌株依赖性的代谢物谱变化，花青素衍生物、原儿茶酸和γ-谷氨酰甲硫氨酸等生物活性化合物水平升高。电子舌分析表明发酵后风味特征改善，主要体现为酸味和鲜味增强，苦味和涩味降低。埃博霉素A在多个发酵组中相对丰度增加，但其代谢物身份、实际浓度和生物学意义需通过靶向定量和功能验证进一步确认。Pearson相关分析表明，增强的体外活性与酚类化合物、氨基酸衍生物和微生物代谢物的积累显著相关。不同微生物表现出菌株依赖性的代谢调控模式，其中枯草芽孢杆菌和罗伊氏柠檬酸杆菌发酵组在某些酶抑制和抗菌试验中表现出相对较强的活性。总体而言，功能微生物发酵有效调控了番荔枝果汁的营养组成、代谢物谱、感官质量和体外生物活性，为其进一步加工和开发为功能性发酵饮料提供了实验依据。然而，这些体外活性的生理相关性以及代谢物-活性关联仍需通过靶向代谢物定量、细胞模型和动物研究进一步验证。

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