narrowPASEF：一种样本感知的diaPASEF方法优化策略，提高低丰度蛋白质的差异蛋白质组学性能

《Analytical Chemistry》：narrowPASEF: A Sample-Aware diaPASEF Method Optimization Strategy Improving Differential Proteomics Performance on Low-Abundance Proteins

　　

基于质谱的蛋白质组学领域的最新仪器和计算创新，凭借前所未有的蛋白质组覆盖度和深度，为生物标志物发现带来了新的希望。数据非依赖采集（DIA）方法在此背景下极具前景，因其可改善蛋白质组覆盖度、降低缺失值率并提高定量精度。然而，DIA方法也面临自身挑战，如数据复杂度增加、循环时间延长以及背景噪声升高。在本工作中，研究人员针对timsTOF平台提出了一种样本感知的diaPASEF方法优化策略。首先在标准HeLa裂解液上进行了全面的方法优化。然后，使用一个经真实值校准的样本系列——该系列由不同数量的UPS掺入复杂拟南芥（Arabidopsis）背景构成——在受控条件下模拟差异分析。这些基准实验证明了使用narrowPASEF在差异蛋白质发现中的明确优势。最后，将该策略应用于真实使用案例的生物样本，对纯化的小鼠星形胶质细胞在两个不同条件下进行了差异分析。narrowPASEF使蛋白质组深度提升了13%（以变异系数CV<20%定量的蛋白质计），并导致差异表达蛋白增加了68%（435 vs 729）。这些结果为实现更精确、更全面的生物标志物生物学功能分析提供了机会，有助于更深入地理解疾病机制。研究人员样本感知的narrowPASEF策略的优势在低丰度蛋白质上体现得最为显著。总体而言，这些结果为未来更有价值、更稳健的生物标志物发现展现了前景。

**论文解读**

**研究背景与问题**
基于高分辨率质谱（MS）的蛋白质组学进展为生物标志物发现提供了巨大潜力，但传统MS的主要问题之一是缺失值，导致差异分析统计效能差。数据非依赖采集（DIA）策略的最新发展通过帮助缓解缺失值问题，提高了定量准确性和精度，进一步增强了发现潜力。目前，蛋白质组学社区的重点正转向增加蛋白质组深度，特别是改善低丰度蛋白质的定量。在timsTOF仪器上实施diaPASEF，利用离子迁移率（IM）作为额外分离维度，显著增加了蛋白质组深度。然而，标准diaPASEF方法通常使用较宽的IM扫描范围以最大化覆盖肽离子云，但宽IM范围会降低谱图质量，因为单一窗口内多个肽离子同时碎裂，其中许多不贡献于最终结果，从而增加谱图噪声，降低信噪比。此外，宽窗口还会增加TIMS cartridge中离子的复杂度，降低TIMS池的选择性。谱图质量下降可导致鉴定减少或错误分配，进而引起缺失值或错误定量。因此，需要一种系统性的优化策略，通过详细研究肽离子云，在IM与质荷比（m/z）平面上选择感兴趣区域进行碎裂，以平衡获得和丢失的肽段，减少循环时间，提高每峰数据点数量，改善峰定义，最终增强定量和差异分析性能。

**研究内容与结论**
研究人员提出narrowPASEF，一种样本感知的diaPASEF采集方法优化策略，旨在提高差异蛋白质组学性能。首先通过ddaPASEF实验表征肽离子云的离子迁移率和m/z分布，指导离子迁移率范围选择和碰撞能量坡道优化。然后将这些观察应用于细化diaPASEF隔离窗口布局，将采集聚焦于信息最丰富的离子迁移率区域，并评估了这种更窄采集空间的分析后果，包括获得或可能丢失的肽段群体。在标准HeLa裂解液优化、基准校准掺入实验（UPS掺入拟南芥背景）以及真实生物学样本（小鼠EAE模型星形胶质细胞）中进行了验证。结果表明，narrowPASEF改善了稳健的蛋白质定量，尤其对低丰度蛋白质，在校准掺入和真实生物样本队列中均提高了差异蛋白质组学性能。该论文发表在《Analytical Chemistry》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用的关键技术方法包括：ddaPASEF用于初步离子迁移率范围优化和碰撞能量坡道优化；diaPASEF用于最终数据采集，窗口布局根据样本特异性ddaPASEF结果进行裁剪；数据使用DIA-NN进行无库处理，差异分析使用ProStaR软件进行。样本队列来源包括：标准HeLa Pierce消化液、校准的UPS1掺入拟南芥（Arabidopsis thaliana）背景样本系列（含不同浓度UPS1），以及来自EAE诱导小鼠模型和对照小鼠的纯化星形胶质细胞样本（每种条件4个生物学重复）。

**研究结果**

**1. 初步ddaPASEF采集以缩小IM范围：CV<20%定量的蛋白质和肽段数量增加**
通过使用标准HeLa消化液，比较不同IM范围（从宽0.6–1.6 kV·s^–2到窄0.7–1.25 kV·s^–2）的ddaPASEF方法，发现窄方法（0.7–1.25 kV·s^–2）在CV<20%条件下蛋白质组数量增加66%，肽段增加78%。窄方法减少了仅由1或2个肽段鉴定的蛋白质组，增加了由4个以上肽段鉴定的蛋白质组，表明提高了结果的可靠性。窄方法特有的肽段主要集中在m/z<1200、氨基酸长度7–30的区域，且双电荷肽离子数量增加3倍，说明窄方法聚焦于数据复杂度最高的区域。

**2. 碰撞能量优化改善碎片离子相关性，双电荷肽在不同能量坡道中一致性最高**
通过测试不同碰撞能量坡道，发现线性坡道（59–20 eV应用于IM 1.6–0.6 kV·s^–2）在CV<20%的蛋白质组数量和碎片离子重复性方面表现最佳。双电荷肽在所有坡道中均给出最佳的b-和y-离子谱图质量，且数量最多。无动态排除的实验显示碎片离子相关性更高，表明动态排除会降低数据质量。结论：选择坡道2用于DIA优化，并进一步验证了在DIA中的有效性。

**3. 校准的UPS标准掺入拟南芥背景混合物突出了样本感知数据采集方法优化策略的优势：在10 amol条件下差异蛋白质发现提高50%**
通过将已知量的48个UPS1蛋白掺入恒定拟南芥背景，在受控条件下评估差异蛋白质组学性能。首先通过代表性样本的DDA分析指导窄离子迁移率窗口设计，将diaPASEF窗口从16个减少到11个，循环时间从1.8秒缩短至1.27秒。在最低掺入量10 amol时，窄方法使UPS1蛋白定量数量增加50%（16到24个），拟南芥背景蛋白定量增加13%。差异分析（比较各掺入条件与2500 amol参考条件）显示，narrowPASEF在所有比较中提高了UPS1蛋白的差异鉴定，最低掺入量时差异蛋白数量增加50%。Youden's J指数（灵敏度-假阳性率）在所有掺入水平均高于标准方法，表明净差异分类性能改善。中位绝对倍数变化误差在多个较低掺入量下降，表明折叠变化准确性提高。

**4. 将narrowPASEF策略应用于真实差异蛋白质发现研究：差异表达蛋白增加68%**
将优化策略应用于小鼠脑源性分选星形胶质细胞队列（EAE疾病组与对照组）。通过初步DDA分析将窗口从16个减少到10个，循环时间从1.8秒降至1.17秒，每峰平均数据点从8.6增至11.2。narrowPASEF使定量蛋白质组总数增加3%（平均10,898 vs 11,005），差异蛋白发现数量在1% FDR下显著增加68%（标准方法729 vs narrowPASEF 435? 原文：435 vs 729，但注意是标准方法435，窄方法729？实际上原文说“led to a 68% (435 vs 729) increase”，即从435增加到729，增加68%。所以narrowPASEF发现729个差异蛋白，标准方法435个）。narrowPASEF独有的差异蛋白占45%，标准方法仅7%。基因本体（GO）富集分析显示，narrowPASEF发现了更多与疾病相关的生物学功能，如蛋白激酶B激活、星形胶质细胞增殖（通过JNK激酶级联）、血脑屏障重塑等，而标准方法未发现。下调蛋白中，narrowPASEF发现了与转化生长因子β和骨形态发生因子刺激相关的细胞反应蛋白，这些蛋白参与抑制星形胶质化和间接神经保护，其下调可能解释疾病进展。

**总结讨论与结论**
**总结讨论**：研究人员指出，narrowPASEF通过系统地优化diaPASEF采集方法，聚焦于高密度双电荷肽离子区域，增强了信息检索，抵消了宽IM范围带来的潜在数据损失。优化策略只需要一次代表性样本的ddaPASEF运行。narrowPASEF通过减少循环时间和增加每峰数据点，实现了深度蛋白质组覆盖（超过11000个蛋白质组），并显著提高差异蛋白发现（最高68%），其中45%的候选生物标志物是narrowPASEF独有的。这些候选物可能揭示星形胶质细胞机制的新功能。该策略对当前主要关注减少循环时间的方法（如slicePASEF、synchroPASEF、midiaPASEF）具有借鉴意义，可整合narrowPASEF以充分利用timsTOF仪器的高采集速度和宽动态范围。虽然缩小离子迁移率范围定义了narrowPASEF的采集空间，但观察到的分析改进不能单一归因于此参数，而是反映了聚焦信息最丰富区域、调整窗口布局、优化碰撞能量和减少循环时间的综合效果。

**结论翻译**：总之，本研究证明了以样本感知方式系统优化diaPASEF数据采集方法、聚焦于高密度双电荷肽离子区域的益处。研究人员的优化策略仅需一次对代表性样本池的初步ddaPASEF运行。已表明该方法增强了信息检索，抵消了与宽IM范围相关的潜在数据损失。优化的方法称为narrowPASEF，通过减少循环时间和增加每峰数据点，在研究人员的用例中实现了从分选的小鼠星形胶质细胞中深度蛋白质组覆盖超过11000个蛋白质组。更重要的是，与标准diaPASEF方法相比，差异蛋白发现显著增加高达68%。45%的发现候选生物标志物是narrowPASEF独有的。这些候选物可能关键地揭示提供对星形胶质细胞机制更深入理解的功能。这强调了研究人员优化策略的效力，并对当前主要集中于有效减少循环时间的最新策略（如slicePASEF、synchroPASEF和midiaPASEF）具有启示意义。将narrowPASEF方法整合到这些最新策略中，有利于充分利用timsTOF仪器（如timsTOF Pro和timsTOF HT）的高采集速度和宽动态范围进行生物标志物发现。虽然缩小离子迁移率范围定义了narrowPASEF中使用的采集空间，但观察到的分析改进不能仅归因于此参数。相反，它们反映了将采集聚焦于信息最丰富的肽离子区域、调整隔离窗口布局、优化碰撞能量坡道和减少采集循环时间的综合效应。研究人员期望这项工作能鼓励未来的探索，邀请在不同样本类型和梯度条件下、不同代仪器中的进一步研究，并可能揭示更多优势。