使用自噬作为AOP中机制指示剂的斑马鱼胚胎纳米毒性评估高通量/高内涵筛选模型

《Environmental Science & Technology》：A High-Throughput/High-Content Screening Model for Nanotoxicity Assessment Using Autophagy as a Mechanistic Indicator within an AOP in Zebrafish Embryos

　　

随着纳米技术的发展，纳米颗粒（NPs）的广泛使用引发了对环境和生物风险的担忧。传统的毒性评估仍受限于低通量以及与不良结局之间较弱的关联。在此，研究人员建立了一种基于不良结局路径（AOP）框架的高通量/高内涵筛选（HTS/HCS）斑马鱼胚胎模型，用于纳米毒性评估，将关键事件与毒性结局相关联。为标准化暴露条件，研究人员优化了浓度，并确定去离子（DI）水是一种稳定的介质，能够保持NPs的物理化学性质而不改变急性毒性。暴露于银纳米颗粒（Ag NPs）诱导了活性氧（ROS）和自噬标志物（LC3和p62）的显著增加。相关性分析显示，这些机制指示剂与死亡率之间存在强关联（ROS：r = 0.97；LC3：r = 0.99；p62：r = 0.92）。通过使用ROS清除剂和自噬抑制剂，研究人员确定ROS积累和自噬紊乱是NP诱导毒性的关键事件。此外，将该平台应用于ZnO和Cu NPs验证了该方法的有效性，并观察到一致的ROS/p62-毒性相关性（ROS：r = 0.84，p = 0.04；p62：r = 0.70，p = 0.01）。这些结果共同建立了一个稳健、可扩展的HTS/HCS平台，将AOP相关的关键事件与不良结局联系起来，用于环境和监管背景下的机制驱动型纳米毒性评估。

**论文解读：基于自噬作为机制指示剂的斑马鱼胚胎纳米毒性高通量/高内涵筛选模型**

**研究背景与问题**

随着纳米技术的快速发展，纳米颗粒（NPs）在生物医学、电子和农业等领域的应用日益广泛，然而其独特的物理化学性质也引发了潜在的环境与生物风险担忧。一旦进入环境或生物系统，NPs会经历转化并与细胞相互作用，改变代谢和信号通路，这些复杂行为给毒性测试带来了变异性，并使方法开发复杂化。传统的体外毒性评估虽然具有实用优势，但无法完全复制整体生物体的生物学过程；动物模型尽管在评估毒代动力学和全身效应方面不可或缺，但受限于成本、伦理考量以及机制分辨率不足。因此，亟需一种兼顾生物学相关性、高通量且能提供机制解析的体内评估平台。

斑马鱼（Danio rerio）胚胎因其发育迅速、产卵量大、光学透明以及遗传易控性，成为评估NP毒性的理想体内模型，并已应用于高通量/高内涵筛选（HTS/HCS）。然而，将HTS/HCS平台应用于NP毒性评估仍处于发展阶段，尤其是在定义针对急性响应的生物体水平机制指示剂方面存在不足。已有研究表明，活性氧（ROS）和自噬失调是多种NP（尤其是银纳米颗粒，Ag NPs）毒性的核心机制。基于此，本研究旨在开发一种以ROS和自噬作为机制指示剂的HTS/HCS斑马鱼胚胎模型，用于急性纳米毒性评估，并纳入不良结局路径（AOP）框架，以增强机制解析能力与通量。

**研究内容与意义**

研究人员通过合成高毒性的Ag NPs和低毒性的Au NPs作为模型NP，首先优化了暴露条件，确定去离子（DI）水能最大程度保持NP的物理化学稳定性且不影响毒性结果。随后，在斑马鱼肝脏上皮（ZLE）细胞和斑马鱼胚胎中验证了ROS生成和自噬紊乱（以LC3和p62为标志物）作为关键事件的作用。通过相关性分析，发现这些机制指示剂与死亡率之间存在强相关性（ROS：r=0.97；LC3：r=0.99；p62：r=0.92）。利用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和自噬抑制剂氯喹（CQ）进行机制研究，证实ROS积累和自噬紊乱是NP诱导毒性的关键驱动因素。最后，将该平台应用于ZnO NPs和Cu NPs进行验证，观察到一致的ROS/p62-毒性相关性（ROS：r=0.84，p=0.04；p62：r=0.70，p=0.01），证明了平台的稳健性和适用性。该研究建立了一个可扩展的、以AOP为导向的HTS/HCS平台，将机制性关键事件与不良结局联系起来，为环境与监管背景下的纳米毒性评估提供了标准化工具，具有重要的方法学意义和实际应用价值。论文发表在《Environmental Science》。

**主要关键技术方法**（不超过250字）

本研究采用的关键技术方法包括：①利用透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）和Zeta电位分析对NP进行物理化学表征；②在斑马鱼肝脏上皮（ZLE）细胞系和斑马鱼胚胎中，通过荧光探针DCFH-DA检测ROS水平，使用免疫荧光染色检测LC3和p62（自噬标志物）表达，利用LysoTracker Red评估溶酶体活性；③采用3D打印胚胎定位装置结合96孔板进行HTS/HCS荧光成像（ImageXpress Micro共聚焦系统）；④使用GraphPad Prism进行非线性回归计算LC₅₀，并通过Spearman相关性分析评估机制指标与死亡率之间的关系。样本来源：野生型AB和Tg(LFABP:EGFP)斑马鱼来自成功大学斑马鱼核心实验室、台湾中央研究院斑马鱼核心设施以及国家卫生研究院。

**研究结果**

**3.1 本研究中NP的物理化学表征**：合成了约13 nm的柠檬酸盐包被的Ag NPs和Au NPs，TEM显示球形形态，DLS测得其在水中的流体动力学直径分别为16.2 nm和34.8 nm，Zeta电位分别为-55.5 mV和-52.1 mV，多分散性指数（PDI）均低于0.3，表明胶体稳定性好。Ag NPs代表高毒性，Au NPs代表低毒性。

**3.2 针对监管测试的暴露条件优化**：通过比较DI水、鱼水和PTU溶液三种介质，发现Ag NPs在DI水中的毒性最高（DI水 > PTU > 鱼水），而Au NPs无显著差异。物理化学表征显示，在鱼水和PTU溶液中，两种NP的流体动力学直径增大、表面电荷降低，分散性变差。因此，DI水被选为标准暴露介质，以最小化介质对NP性质的干扰。

**3.3 ROS作为HTS/HCS模型中的机制指示剂**：在ZLE细胞和斑马鱼胚胎中，Ag NPs显著诱导ROS产生，而Au NPs未引起明显响应。非生物干扰实验表明，在洗涤后残留的NP水平下，NP-探针相互作用对ROS信号贡献极小。ROS与死亡率呈强正相关（r=0.97），支持ROS作为NP毒性关键事件的机制指示剂。

**3.4 LC3在自噬中作为纳米毒性关键事件（KE）的表达**：Ag NPs在ZLE细胞和斑马鱼胚胎中均诱导了浓度依赖性的LC3表达增加，而Au NPs无显著效应。LC3表达与死亡率强相关（r=0.99），表明LC3可作为NP诱导自噬的机制指示剂。

**3.5 p62作为NP诱导自噬紊乱的机制指示剂**：Ag NPs在ZLE细胞和斑马鱼胚胎中均引起p62积累，呈浓度依赖性，而Au NPs无显著变化。p62与死亡率的相关性为r=0.92，且在全部毒性范围内表现出最一致的关联，提示p62可作为急性纳米毒性最稳健的机制指示剂。

**3.6 ROS和自噬在生物体致死中的关键作用**：通过ROS清除剂NAC处理，显著降低了Ag NPs诱导的细胞死亡和胚胎死亡率，证实ROS是NP致死的关键驱动因素。通过自噬抑制剂CQ处理，发现早期自噬具有保护作用，但长期抑制自噬增加死亡率，表明自噬在NP毒性中具有双重作用。

**3.7 溶酶体活性对NP暴露表现出非线性变化**：Ag NPs诱导了浓度依赖但非线性的溶酶体活性变化，而Au NPs无显著影响。溶酶体活性与死亡率的相关性较弱（r值较低），提示其作为急性毒性预测指标不如ROS和自噬标志物可靠。

**3.8 利用多种NP验证HTS/HCS纳米毒性平台**：将平台应用于ZnO NPs和Cu NPs，发现ROS和p62的荧光强度与死亡率之间均存在显著正相关（ROS：r=0.84，p=0.04；p62：r=0.70，p=0.01），验证了平台的稳健性和跨NP适用性。

**讨论与结论**

**讨论总结**：本研究建立了一个AOP导向的HTS/HCS斑马鱼胚胎平台，通过优化暴露条件（DI水）和确认ROS与自噬紊乱作为关键事件，实现了对NP毒性的机制化高通量评估。p62因表现出最一致的浓度-响应关系，被推荐为急性纳米毒性的稳健机制指示剂。该平台在ZnO NPs和Cu NPs上的验证进一步支持其跨NP适用性。与现有平台相比，本研究整合了3D打印胚胎定位、标准化暴露条件、自动成像和开源图像分析，并引入了机制性终点，增强了可重复性和可解释性。讨论还涉及了暴露介质选择（DI水作为基线，同时考虑生理/环境介质）、自噬标志物（LC3和p62）的联合解读、以及NAC的多重作用机制（除了清除ROS，还能螯合Ag⁺）。此外，平台遵循3Rs原则，通过利用亚致死浓度下的激素效应（hormesis）优化剂量选择，支持预毒性评估。

**研究结论翻译**：这些结果共同建立了一个稳健、可扩展的HTS/HCS平台，将AOP相关的关键事件与不良结局联系起来，用于环境和监管背景下的机制驱动型纳米毒性评估。