《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Functional annotation of PBK missense SNPs and dysregulation in multiple myeloma: A bioinformatics approach integrating identification of natural inhibitors
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T-LAK细胞源性蛋白激酶(PBK/TOPK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，对于DNA损伤修复、细胞分裂、有丝分裂和肿瘤生长至关重要。有害的错义单核苷酸多态性(nsSNPs)可能改变PBK的生物学活性和结构稳定性，从而促进癌症进展。因此，本研究旨在使用整合的计算策
T-LAK细胞源性蛋白激酶(PBK/TOPK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，对于DNA损伤修复、细胞分裂、有丝分裂和肿瘤生长至关重要。有害的错义单核苷酸多态性(nsSNPs)可能改变PBK的生物学活性和结构稳定性，从而促进癌症进展。因此，本研究旨在使用整合的计算策略，彻底识别和表征PBK基因中的致病性nsSNPs，并评估其在多发性骨髓瘤中的潜在临床和治疗相关性。此外，研究人员筛选了来自茶树(Camellia sinensis)的化合物，以识别三种PBK突变体的潜在抑制剂。采用多种计算方法评估这些化合物的药物相似性和结合稳定性。为了识别错义变异，研究人员使用了多种预测工具，包括SIFT、SNPs&GO、PolyPhen-2、PROVEAN、MetaSNP和FATHMM。DeepREx-WS用于评估序列保守性，而MutPred2和HOPE用于结构评估。SWISS-MODEL用于构建结构模型；HDOCK、PyRx 0.8和PyMOL (v2.3.3)用于分子对接、虚拟筛选和对接复合物可视化；CScape和Dr. Cancer用于预测癌症相关改变。在NCBI dbSNP数据库识别的421个错义SNPs中，有三个变异——H158P、G188E和G188R被发现跨物种高度保守，位于形成螺旋或链的蛋白质区域，并与蛋白质稳定性降低相关。结构分析揭示，这三个突变改变了PBK蛋白的大小、电荷和疏水性。对接分析揭示了TP53与野生型和突变型PBK蛋白在结合相互作用和能量上的差异。在从茶树筛选的七种化合物中，Brassinolide是PBK突变体H158P和G188R最有前景的候选物，而Castasterone对G188E突变体显示出最高亲和力，表明其作为靶向治疗剂的潜力。对muTarget基因表达和Kaplan–Meier生存数据的分析表明，PBK突变与特定的基因表达变化相关。然而，在多种骨髓瘤中，升高的PBK表达（而非突变状态）与不良预后显著相关。研究人员的综合计算机模拟研究为所识别的PBK改变的结构和功能后果提供了见解。这些发现支持PBK可能作为治疗多发性骨髓瘤的潜在预后生物标志物和治疗靶点的假说。
**研究背景与问题**
PBK/TOPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与DNA损伤修复、细胞分裂、有丝分裂和肿瘤生长。错义单核苷酸多态性(nsSNPs)可能改变PBK的生物学活性和结构稳定性，促进癌症进展。多发性骨髓瘤(MM)是一种不可治愈的血液恶性肿瘤，以骨髓中恶性浆细胞克隆增殖为特征，常伴有骨破坏、肾功能损害和贫血。尽管PBK/TOPK被报道为致癌激酶，但既往研究多聚焦于基因表达模式、信号通路和抑制剂开发，缺乏对错义突变及其结构后果的系统评估。此外，目前尚无FDA批准的靶向PBK的疗法，现有药物副作用严重。因此，本研究旨在通过整合计算策略，系统优先鉴定PBK基因中的致病性nsSNPs，并探索茶树(Camellia sinensis)来源的天然化合物作为潜在抑制剂，为多发性骨髓瘤的预后标志物和治疗靶点提供基础。
**研究内容与结论**
研究人员利用NCBI dbSNP数据库收集421个PBK错义SNPs，经SIFT、SNPs&GO、PolyPhen-2、PROVEAN、MetaSNP、FATHMM六种工具预测，筛选出8个有害变异；再通过I-Mutant 2.0和MUpro评估稳定性，DeepREx-WS分析保守性，MutPred2和HOPE预测致病机制和结构效应，PSIPRED确定二级结构位置，最终选择位于α-螺旋或β-链区域的三个突变（H158P、G188E、G188R）进行后续分析。同源建模（SWISS-MODEL）和SAVES验证确认模型质量可靠。CScape和Dr. Cancer预测所有三个突变均为致癌性。分子对接（HDOCK）显示，突变型PBK与TP53的亲和力低于野生型，表明突变可能削弱PBK-TP53相互作用。从茶树中筛选的29种化合物中，Brassinolide对H158P和G188R突变体，Castasterone对G188E突变体显示出最佳结合亲和力和ADMET特性。muTarget分析显示，PBK突变可能影响ANKRD37、GPR155等基因表达；Kaplan-Meier生存分析表明，PBK高表达与多发性骨髓瘤患者总生存期显著缩短相关（HR=1.38，p=0.0023）。STRING和GeneMANIA分析揭示PBK与CCNB1、CDK1等10种蛋白及DLG1、SMAD4等20种基因存在相互作用。结论：计算机模拟综合分析表明，PBK的H158P、G188E、G188R突变可能通过改变蛋白结构、稳定性及与TP53的相互作用促进癌症；PBK表达升高是多发性骨髓瘤的预后不良标志物；Brassinolide和Castasterone是潜在天然抑制剂。论文发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。
**主要关键的技术方法**
数据来源：NCBI dbSNP数据库（421个错义SNPs，蛋白ID NP_060962.2）。
有害性预测：SIFT、SNPs&GO、PolyPhen-2、PROVEAN、MetaSNP、FATHMM。
稳定性预测：I-Mutant 2.0、MUpro。
保守性分析：DeepREx-WS。
致病机制与结构效应：MutPred2、HOPE。
二级结构定位：PSIPRED。
同源建模与验证：SWISS-MODEL、SAVES（ERRAT、PROCHECK）。
致癌性预测：CScape、Dr. Cancer。
分子对接：HDOCK（蛋白-蛋白）、PyRx 0.8/AutoDock Vina（蛋白-配体）。
表达与生存分析：muTarget（基因表达关联）、Kaplan-Meier plotter（总生存期）。
互作网络：STRING（蛋白-蛋白）、GeneMANIA（基因-基因）。
ADMET评估：SwissADME、ProTox 3.0。
未使用特定样本队列，分析基于公共数据库（如NCBI、muTarget、Kaplan-Meier plotter中的多发性骨髓瘤数据）。
**研究结果**
**3.1 有害性和功能性SNPs预测**：经六种工具联合筛选，421个错义SNPs中8个被所有工具预测为有害/致病（表1）。
**3.2 蛋白稳定性预测**：I-Mutant 2.0和MUpro分析显示，6个SNPs（G41S、H158P、D167V、D186E、G188E、G188R）降低蛋白稳定性（表2）。
**3.3 nsSNPs进化保守性**：DeepREx-WS表明这6个突变均位于高度保守且埋藏的残基（表3）。
**3.4 致病分子机制预测**：MutPred2揭示这些突变可能影响催化位点、变构位点、金属结合、DNA结合、跨膜蛋白及二级结构（表4）。
**3.5 变异结构效应预测**：HOPE分析显示突变改变了氨基酸大小、电荷和疏水性，可能破坏蛋白结构（表5，图2）。
**3.6 错义SNPs在二级结构中的区域鉴定**：PSIPRED发现H158P位于α-螺旋，G188E和G188R位于β-链，其余位于卷曲区，因此选择这三个突变进一步分析（图3）。
**3.7 野生型和突变型TOPK蛋白结构建模与验证**：SWISS-MODEL构建模型，QMEAN Z-score > -0.4，ERRAT > 94%，Ramachandran图显示>86%残基在允许区，模型质量可靠（表6，图5）。
**3.8 致癌错义SNPs分析**：CScape和Dr. Cancer均预测H158P、G188E、G188R为致癌性，其中H158P和G188E为高置信度致癌变异（表7）。
**3.9 PBK突变与基因表达关联及预后意义**：muTarget分析表明PBK突变可能影响多发性骨髓瘤中ANKRD37、GPR155等基因表达；Kaplan-Meier分析显示PBK高表达与总生存期缩短显著相关（HR=1.38，p=0.0023，图6）。
**3.10 基因-基因相互作用**：STRING显示PBK与CCNB1、CDC20、CDK1等10种蛋白相互作用；GeneMANIA预测PBK与DLG1、SMAD4等20个基因存在共表达、物理相互作用等（图7）。
**3.11 盲分子对接**：蛋白-蛋白对接显示，突变型PBK与TP53的结合亲和力（-277.79至-280.73 kcal/mol）低于野生型（-282.77 kcal/mol），且氢键和盐桥数量变化（表8，图8）。药物发现对接中，29种化合物比对照药HI-TOPK-032结合亲和力更高（> -7.6 kcal/mol）（表9）。
**3.12 化合物ADME与毒性**：SwissADME和ProTox 3.0评估显示，四个化合物符合Lipinski规则且无毒性，但一种化合物胃肠吸收差（补充表2-3）。
**3.13 非键相互作用分析**：Brassinolide对H158P和G188R，Castasterone对G188E表现出最佳相互作用几何和ADMET特性（图9，补充表4）。
**讨论总结**
研究讨论了错义SNPs在遗传疾病中的重要性，PBK在细胞功能中的多重作用，以及IL-6、FOXM1等通路在多发性骨髓瘤中的关联。通过整合多种预测算法，提高了筛选有害SNP的可靠性。六个有害突变位于高度保守区，可能导致蛋白稳定性下降及功能改变。H158P、G188E、G188R位于α-螺旋或β-链，对结构影响更显著。模型验证表明结构可靠。Kaplan-Meier分析证实PBK高表达与多发性骨髓瘤不良预后相关。蛋白-蛋白相互作用网络显示PBK与多个关键蛋白互作。分子对接发现突变降低PBK-TP53结合亲和力，可能影响肿瘤抑制功能。天然化合物Brassinolide和Castasterone显示出对突变体PBK的抑制潜力。同时指出计算预测的局限性（如假阳性、需实验验证），并建议未来通过分子动力学模拟、功能实验和临床研究验证。
**研究结论翻译**
本研究利用计算技术检测了三种不同PBK基因突变（H158P、G188E和G188R）对蛋白质功能的影响。结果表明，这些突变可能通过改变PBK蛋白的结构及其与肿瘤抑制蛋白TP53的相互作用，促进癌症发展。研究人员将PBK鉴定为抗癌药物的潜在靶点，因为PBK表达升高与多发性骨髓瘤的不良预后相关。在计算机模拟药物筛选实验中，两种化合物Castasterone和Brassinolide对突变的PBK蛋白显示出强结合亲和力，表明它们作为候选抑制剂的潜力。本研究在多发性骨髓瘤背景下，综合整合了有害PBK错义SNP优先排序、结构和功能表征、生存分析、突变相关基因表达分析以及茶树天然化合物的筛选。识别的变异（H158P、G188E和G188R）为PBK功能和潜在治疗靶点提供了新见解。然而，本研究的主要缺点是分析完全依赖计算方法，缺乏实验支持。此外，分子对接使用近似力场和能量函数，可能无法准确代表PBK–TP53相互作用或预测Castasterone和Brassinolide在生理条件下的抑制效果。这凸显了需要进一步使用临床前动物模型、功能实验和分子动力学模拟来验证这些发现的生物学意义。另一个局限性是生存分析基于PBK表达而非突变特异性信息，因此无法直接确定检测到的nsSNPs与患者生存结局之间的关系。此外，公开数据集可能样本量有限且肿瘤特征多样，可能影响预后关系的解释。未来的研究需结合突变特异性临床数据和功能研究，以确定PBK突变在多发性骨髓瘤进展和预后中的确切作用。
