高活性 Cr(VI) 还原酶 BCR005 中一种新型 CXXC 基序介导的铬酸盐还原机制

《Journal of Hazardous Materials》：A Novel CXXC Motif-Mediated Chromate Reduction Mechanism in the High-Activity Cr(VI) Reductase BCR005

　　

摘要

铬酸盐还原酶是六价铬 [Cr(VI)] 生物修复的核心，但其催化机制在很大程度上仍未被表征。在此，我们报告了 BCR005，一种高效的天然铬酸盐还原酶，其 k_cat 为 20.8 s?1，比之前报道的两种具有可用 k_cat 值的天然铬酸盐还原酶（ChrR, 3.7 s?1; NemA, 2.1 s?1）高出 5.6 倍和 9.9 倍。

rBCR005（融合 C 端 His 标签的重组 BCR005）及其四个 CXXC 基序突变体（C10S, C13S, DS 和 DA）进行了异源表达和纯化。埃曼氏测定法证实 CXXC 基序形成了分子内二硫键。

DS 和 DA 双突变体显示出催化活性的完全丧失，而单突变体保留了部分活性（分别为 rBCR005 V_max 的 77% 和 90%），表明两个半胱氨酸残基之间存在功能冗余。

表面等离子体共振 (SPR) 分析揭示，CXXC 基序作为铬酸盐结合位点，而不是 FMN 结合位点。发现 FMN 结合是铬酸盐识别的先决条件，且两个半胱氨酸残基表现出明显的功能不对称性：Cys10 在铬酸盐识别和构象稳定性中起主导作用，而 Cys13 作为 FMN 结合口袋的守门人。二硫键本身对催化并非必不可少，但有助于维持 FMN 和铬酸盐结合口袋的空间耦合，从而实现从 NADPH 到 Cr(VI) 的高效电子转移。

据我们所知，这是首次报告任何已表征的铬酸盐还原酶中存在功能性的 CXXC 基序，揭示了一种此前未报道的调控机制。这些发现为合理工程化设计高效生物催化剂以实现铬生物修复提供了明确的分子靶点。

引言

铬被广泛用于电镀、皮革鞣制和不锈钢生产等行业，导致六价铬 [Cr(VI)] 广泛释放到环境中 [1], [2]。由于其高氧化能力、溶解性及穿透生物膜的能力，Cr(VI) 被国际癌症研究机构列为 1 类致癌物，会导致 DNA 损伤 [3]、氧化应激 [4] 和器官毒性 [5]。与传统物理和化学修复方法相比，将 Cr(VI) 微生物还原为毒性较小且移动性较差的三价铬 [Cr(III)][6] 为 Cr(VI) 脱污提供了一种可持续、成本效益高且环保的替代方案 [7]。

迄今为止，已从多种耐 Cr(VI) 细菌中鉴定出多种铬酸盐还原酶，包括 ChrR[8]、YieF[9]、NsfA[10]、NemA[11]、NfrA2[12]、SchR[13] 和 NfoR[14]。这些酶通常利用 NAD(P)H 作为电子供体，并需要黄素辅因子 (FAD 或 FMN) 或金属离子作为催化中心。然而，除了已鉴定出晶体结构和四个关键催化活性残基（Tyr128, Glu146, Arg125 和 Tyr85）的 ChrR[15] 外，其辅因子和底物结合位点以及分子识别模式背后的催化机制在很大程度上仍不清楚。此外，这些天然酶的催化效率通常不足以用于实际应用，特别是在高 Cr(VI) 浓度或极端环境条件下。因此，鉴定具有高活性的新型铬酸盐还原酶并探索其催化机制，对于推进生物修复技术至关重要。

我们之前的工作首次报道了类黏菌芽孢杆菌 (Bacillus paramycoides) Cr6 [16] 中存在独特的双途径铬代谢系统，该系统协同实现了高效的 Cr(VI) 还原和固定。在该系统中，铬酸盐还原酶 BCR005 和铬结合蛋白 BCB765 分别作为两条途径的末端效应蛋白，共同介导菌株的高 Cr(VI) 耐性和去除能力。然而，BCR005 的具体催化机制及其高活性背后的分子基础仍不清楚，这阻碍了该双途径系统的进一步工程化应用。为解决这一知识缺口，我们首先分析了 BCR005 的保守功能结构域，并在其序列中鉴定出一个 CXXC 基序。

CXXC 基序是一种保守的富含半胱氨酸的结构域，广泛分布于多种氧化还原酶家族中，包括硫氧还蛋白 [17] 和蛋白质二硫键异构酶 [18]。在大多数已表征的系统中，该基序中的两个半胱氨酸残基形成可逆还原的氧化还原活性二硫键，介导电子转移和二硫键重排等核心催化过程。先前的研究表明，CXXC 基序参与广泛的细胞功能，包括氧化应激反应 [19]、金属离子螯合 [20], [21]、二硫键异构化和蛋白质折叠。然而，据我们所知，迄今为止尚未在任何经过实验验证的铬酸盐还原酶中报道或功能表征过功能性的 CXXC 基序。这一发现表明，BCR005 可能采用一种此前未描述的催化机制来进行 Cr(VI) 还原，从而扩展了含 CXXC 氧化还原酶的已知功能范围。

鉴于 CXXC 基序在调节多种氧化还原酶的催化和功能特性中的关键作用，结合发现 BCR005 序列中携带一种此前未报道的 C1?-TS-C13 基序，我们假设这种独特的类似 CXXC 的结构域可能是 BCR005 高催化活性背后的关键结构元素。

为了验证这一假设，我们采用定点突变特异性修饰 C1?-TS-C13 基序内的两个半胱氨酸残基，生成了四个突变变体：STSC (C10S)、CTSS (C13S)、STSS (DS) 和 ATSA (DA)。随后，我们对天然蛋白和突变蛋白进行了系统表征，包括二级结构分析、蛋白质稳定性测定、体外 Cr(VI) 还原活性测定以及蛋白质 - 辅因子和蛋白质 - 底物相互作用的表面等离子体共振 (SPR) 分析。这些实验共同使我们能够确定两个半胱氨酸残基对 BCR005 结构稳定性、催化效率以及对底物和辅因子识别能力的影响，并最终阐明这种类似 CXXC 的基序在 Cr(VI) 还原中的功能作用。

章节片段

菌株与培养条件

耐 Cr(VI) 菌株 Bacillus paramycoides Cr6 (CGMCC No.20390) 已在本期刊中报道 [16]。在该研究中，我们阐明了使菌株 Cr6 能够去除极高浓度 (≤2500 mg/L) Cr(VI) 的双途径机制，并鉴定出两种介导 Cr(VI) 代谢的新型末端效应蛋白。

菌株 Cr6 在优化的培养基中培养（每升含 10 mL 甘油、19.8 g 蛋白胨、5 g 酵母提取物和 5.5 g NaCl，pH 8.0），并

BCR005 的鉴定与序列分析

bcr005 基因编码一个 131 个氨基酸的蛋白。序列比对显示，BCR005 与所有之前表征的铬酸盐还原酶共享低序列一致性（表 2），表明它是一种新型 Cr(VI) 还原酶。值得注意的是，在 BCR005 的 N 端区域鉴定出一个保守的 CXXC 基序 (Cys10-Thr11-Ser12-Cys13)（图 1），这是硫氧还蛋白超家族氧化还原酶的特征。该基序尚未在任何已知的铬酸盐

BCR005 及其突变体的 FMN 结合亲和力

通过 SPR 测定 FMN 与 rBCR005 变体之间的结合亲和力，定量参数总结于表 6，拟合曲线见 图 S6。值得注意的是，此处呈现的 K_D 值是在所采用的特定实验条件下由 SPR 确定的表观平衡解离常数。由于蛋白质固定化和 SPR 溶液体系与生理环境之间固有可能存在的差异，

突变体的底物结合与催化活性

进行三次重复的单周期注射测定，以评估 rBCR005 变体与催化系统各个组分之间的结合相互作用。当作为单一分析物注射到固定化的野生型或突变体 BCR005 表面时，未检测到 NADPH 或铬酸钠的特异性结合响应（代表性传感图见补充信息 图 S7 和 S8）。为了表征催化相关条件下的铬酸盐结合，一个

结论

总之，本研究鉴定出 rBCR005 是一种新型铬酸盐还原酶，在所有有数据可用的天然铬酸盐还原酶中表现出最高的催化活性。系统的突变分析结合 SPR 结合测定和 体外 活性表征，揭示 CXXC 基序 (Cys10-Thr11-Ser12-Cys13) 是 BCR005 催化的关键结构和功能元素。

CXXC 基序内的两个半胱氨酸残基表现出明显的功能

环境意义

Cr(VI) 被世界卫生组织列为 116 种 A 类致癌物之一，也是许多国家的优先污染物。它是一种众所周知的致癌物、致畸物和致突变物，由于其强迁移能力和溶解性，对所有生物系统都有毒性作用。它大量持久存在于皮革、电镀和化学工业的废渣和废水中。

将 Cr(VI) 微生物还原为毒性较小、不移动的三价铬 (Cr(III)) 代表了一种

重要性声明

Cr(VI) 被世界卫生组织列为 116 种 A 类致癌物之一，也是许多国家的优先污染物。它是一种众所周知的致癌物、致畸物和致突变物，由于其强迁移能力和溶解性，对所有生物系统都有毒性作用。它大量持久存在于皮革、电镀和化学工业的废渣和废水中。

将 Cr(VI) 微生物还原为毒性较小、不移动的三价铬 (Cr(III)) 代表了一种

CRediT 作者贡献声明

周晓辉: 指导，资源，经费获取。顾雅文: 撰写 – 原稿，方法论，形式分析，数据整理，概念化。陈筱筱: 验证。符文博: 可视化。迟晓梅: 软件。

利益冲突声明

作者郑重声明，在题为“高活性 Cr(VI) 还原酶 BCR005 中一种新型 CXXC 基序介导的铬酸盐还原机制”的论文中没有利益冲突。

致谢

本研究得到河北省自然科学基金一般项目 (Grant No. C2025208022) 的资金支持。

顾雅文 | 陈筱筱 | 符文博 | 迟晓梅 | 周晓辉

河北省分析测试中心，河北科技大学。石家庄市裕祥街 26 号，河北省，中国，050018