用于脑芯片研究的大鼠皮层细胞冷冻保存

《Journal of Neuroscience Methods》：Cryopreservation of rat cortical cells for brain-on-chip research

　　

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  CryoStor CS10 支持出生后大鼠皮层细胞的低温保存。
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  冷冻细胞在解冻后保留神经元和胶质细胞的组成。
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  功能性网络活性与新鲜培养物保持可比性。
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  低温保存增加了灵活性，并将动物使用量减少了$～$90%。

引言

神经元培养物被广泛用于研究疾病机制、神经毒性、网络发育以及代谢压力的影响（Badley 等，2025 年，Martinez-Orellana 等，2025 年，Oblasov 等，2024 年，Sullivan 等，2024 年，Keles 等，2025 年，Gramowski-Vo? 等，2015 年，Voogd 等，2023 年，Le Feber 等，2009 年，Warm 等，2022 年，Harrill 等，2015 年，Lamberti 等，2023 年）。这些培养物通常由兴奋性和抑制性神经元及星形胶质细胞的异质混合物组成，可能来源于原代皮层组织或多能干细胞。

源于多能干细胞培养物在特定应用中具有优势，例如发育障碍、遗传病模型和人类药物筛选，因为它们包含更有限且控制更好的细胞类型集合（Doorn 等，2024 年，Doorn 等，2025 年）。然而，在细胞异质性、突触可塑性、连接性或网络动力学方面，它们可能代表性较低（Okujeni and Egert, 2019）。三维类器官可能更好地捕捉这些方面的某些内容，但其使用受到高成本、复杂性以及长期培养挑战的限制。

对于许多应用而言，原代皮层培养物仍然是一个有吸引力且实用的模型。然而，一个局限性是它们依赖于新鲜分离的围产期组织。此外，通常只有一部分分离材料可以在特定的时间窗口内使用。因此，大量的幼崽最终可能成为繁育过剩，如果剩余的细胞不能用于其他目的。对分离的皮层细胞进行低温保存提供了一个有前景的解决方案，通过增加实验灵活性并减少动物使用。在实践中，原代皮层组织的成功低温保存被证明具有挑战性，这反映在文献中报道的广泛方案上（Ichikawa 等，2007 年，Mat 等，1988 年，Negishi 等，2003 年，Mok 等，2009 年，Schock 等，2012 年，Quasthoff 等，2015 年，Robert 等，2016 年，Parker 等，2018 年，Pischedda 等，2018 年，Zhou 等，2020 年）。虽然一些研究报告了令人鼓舞的结果（Ishizuka and Bramham, 2020, Antonopoulos 等，2024 年，Parker 等，2018 年），但结果仍然多变，尚未出现广泛采用的标准。虽然市面上有商业低温保存细胞制剂，但它们报道的解冻后存活率往往不足以可靠地生成足够密度的培养物。最近开发的低温保存策略可能有助于解决这些挑战，但其普遍适用性和可重复性需要进一步验证。

CryoStor CS10 之前已被 Parker 等（2018 年）验证用于小鼠胚胎皮层神经元的低温保存，并已应用于敏感干细胞群，包括神经祖细胞（Meiser 等，2023 年）。在此基础上，我们描述了一种基于 CryoStor CS10 的幼鼠新皮层来源细胞方案。解冻后活力为 39% ±10%，细胞得率为 28% ± 13%；存活的细胞形成了适用于电生理学研究的功能性神经元 - 星形胶质细胞网络。无血清冷冻培养基也减少了对动物来源成分的依赖。

章节片段

大鼠新皮层细胞的分离

为了获得皮层细胞，新生大鼠（Wistar/Han; P1; Janvier）通过断头被处死，其头部立即在冰镇 30% 乙醇中冲洗和冷却，随后转移到冰镇 70% 乙醇中，然后再转移到冰镇 DMEM 中。在无菌条件下，首先使用 Castroviejo 弹簧剪刀移除头皮皮肤以分离大脑。接着移除头骨。释放大脑后，将其转移到新鲜 DMEM 中。使用 Dumont 号

低温保存皮层分离物的活力

为了评估和比较新鲜接种细胞和低温保存细胞的活力，我们使用台盼蓝进行了活死细胞测定，并计算了不同分离和接种日期以及不同存储持续时间（长达 2 年）下的冷冻前和解冻后活力。

冷冻前活力平均为 78% $\pm$ 6%。解冻后活力为 39% $\pm$ 10%，得率为 28% $\pm$ 13% 冷冻前活力、解冻后活力或

讨论

我们表明，低温保存的大鼠新皮层来源细胞可用于产生神经元培养物，其形态学和电生理学特征与新鲜制备的培养物基本可比。虽然低温保存显著降低了解冻后的恢复率，但所得培养物保留了相似的星形胶质细胞与神经元比例、相似的抑制性神经元比例，以及在 MEA 上可比的网络水平活性。

与之前低温保存的直接比较

CRediT 作者贡献声明

Gerco C. Hassink: 写作 – 审查与编辑，写作 – 原始草稿，软件，正式分析，数据整理。 Marloes R. Levers: 写作 – 审查与编辑，方法论，调查，数据整理。 Michel J.A.M. van Putten: 写作 – 审查与编辑，监督。

伦理批准

所有动物程序均经荷兰中央动物实验委员会（CCD；批准号 AVD11000202115663）批准，并按照 ARRIVE 指南进行。

人工智能的使用

使用 ChatGPT 协助语言编辑和措辞。所有科学内容、分析、解释和结论均由作者生成、审查和批准。

资助

这项工作由 Rousselot 赞助。赞助商在研究设计；数据的收集、分析或解释；手稿撰写；或提交手稿出版的决定中均没有角色。

竞争利益声明

作者声明他们没有竞争利益。

致谢

所有动物程序均经 荷兰中央动物实验委员会（CCD） 批准（AVD11000202115663），并符合 ARRIVE 指南。

我们衷心感谢 Rousselot 赞助这项工作。Rousselot 在研究设计、数据收集和分析、结果解释或本手稿的撰写和提交中均没有角色。

Gerco C. Hassink|Marloes R. Levers|Michel J.A.M. van Putten