《Aging Cell》：hTERT Immortalization Stabilizes Human Umbilical Cord MSCs and Maintains Their Small Extracellular Vesicles With Preserved Immunomodulatory Activity and Primordial Follicle-Activating Capacity
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细胞衰老是衰老的基本标志，也是间充质基质细胞（MSC）来源的小细胞外囊泡（sEVs）规模化、可重复应用的主要障碍。衰老的人脐带间充质基质细胞（hUCMSCs）表现出增殖能力受损、线粒体稳态破坏和分泌表型改变，这可能损害sEVs的生物活性和治疗可靠性。在此，研究
细胞衰老是衰老的基本标志，也是间充质基质细胞（MSC）来源的小细胞外囊泡（sEVs）规模化、可重复应用的主要障碍。衰老的人脐带间充质基质细胞（hUCMSCs）表现出增殖能力受损、线粒体稳态破坏和分泌表型改变，这可能损害sEVs的生物活性和治疗可靠性。在此，研究人员研究了人端粒酶逆转录酶（hTERT）的过表达是否能减轻衰老相关的退化并稳定sEV功能特性。晚代hUCMSCs表现出典型的衰老特征和线粒体功能障碍，而hTERT表达可显著缓解所有这些变化。功能上，源自衰老细胞的sEVs表现出受损的免疫调节活性，而源自hTERT表达细胞的sEVs则基本恢复了该功能。机制上，衰老与sEV货物改变相关，包括miR-217-5p的富集，这至少部分通过调节受体巨噬细胞中SIRT1相关的炎症信号传导而导致免疫调节效力降低。蛋白质组学分析进一步表明，H11-sEVs保留了类似年轻的蛋白质货物谱，特别是与免疫和炎症调节相关的蛋白质。与此同时，三组来源的sEVs均保留了原始卵泡激活能力，这与它们的蛋白质组谱中广泛保留的PI3K-Akt通路相关蛋白以及卵巢组织中的PI3K-Akt通路激活相一致。在老年雌性小鼠中，H11-sEVs表现出类似年轻的卵巢保护活性。总之，这些发现表明hTERT将细胞衰老与sEV功能衰退解耦联，支持开发用于衰老相关和再生应用的效力稳定型sEV来源，并为衰老细胞来源sEV的生物学作用提供了见解。
**论文解读：hTERT永生化稳定hUCMSCs并维持其sEVs功能**
细胞衰老是衰老的基本标志之一，也是限制间充质基质细胞（MSC）来源的小细胞外囊泡（sEVs，直径约30–150 nm的双层膜囊泡）规模化生产和可重复应用的主要障碍。人脐带间充质基质细胞（hUCMSCs）因来源丰富、免疫原性低而具有临床应用前景，但在体外扩增中不可避免地发生复制性衰老，表现为增殖能力下降、线粒体稳态破坏和分泌表型改变，这可能损害sEVs的生物活性和治疗可靠性。因此，如何获得稳定、可规模化的sEVs来源成为该领域的关键问题。研究人员构建了人端粒酶逆转录酶（hTERT）过表达的hUCMSCs，系统比较了年轻（P7）、衰老（P11）和hTERT挽救（H11）细胞来源sEVs的功能差异，揭示了hTERT永生化稳定细胞和sEV功能的重要机制。相关成果发表在《Aging Cell》。
该研究首先从知情同意产妇的脐带中分离原代hUCMSCs（样本来自南京医科大学附属逸夫医院），并通过慢病毒转染构建hTERT过表达细胞系。sEVs采用切向流过滤（TFF）和尺寸排阻色谱（SEC）从条件培养基中分离，利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电镜（TEM）和Western blot进行表征。功能评估方面，使用小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）极化模型检测免疫调节活性；采用新生小鼠卵巢体外培养模型评估原始卵泡激活能力；通过向10月龄雌性ICR小鼠（购自南京医科大学）尾静脉注射sEVs评价体内卵巢保护作用。此外，还运用蛋白质组学、qRT-PCR、免疫荧光和Western blot等技术分析sEVs货物及相关信号通路。
研究结果分为以下几个方面：
2.1 长期培养过程中hUCMSCs分化能力的改变：通过成骨和成脂诱导分化染色发现，所有检测代次均能成脂分化，但成骨分化能力随传代进行性下降，提示细胞衰老破坏成骨/成脂谱系平衡，且成骨分化受损更明显。
2.2 传代过程中hUCMSCs形态和生长动力学的改变：通过形态观察、生长曲线、SA-β-gal染色、Annexin V/PI凋亡检测、TUNEL染色及γH2A.X蛋白检测，发现晚代细胞出现衰老形态、增殖停滞、SA-β-gal阳性率增加、凋亡增加和DNA损伤积累，确认hUCMSCs在长期培养中发生复制性衰老。
2.3 hTERT过表达hUCMSCs细胞系的建立：通过慢病毒转染建立hTERT-UCMSCs，证实hTERT在mRNA和蛋白水平高表达，平均端粒长度显著增加，并保持成骨和成脂双向分化潜能；免疫缺陷小鼠体内植入3个月无肿瘤形成，核型分析正常，流式细胞术显示细胞维持典型MSC表面标志物（CD73、CD90、CD105阳性，CD19、CD34、CD45、CD31、CD11b、HLA-DR阴性），符合ISCT标准。
2.4 hTERT过表达减轻hUCMSCs衰老相关表型：与P11对照相比，H11细胞增殖能力显著提高，SA-β-gal阳性率降低，凋亡减少，p16/p21表达下降，SASP相关基因（包括炎症因子和基质金属蛋白酶）下调，γH2A.X水平降低，表明hTERT过表达显著缓解复制性衰老。
2.5 hTERT过表达改善hUCMSCs线粒体功能：利用H2DCFDA探针检测显示P10/P11细胞内活性氧（ROS）升高；JC-1染色显示线粒体膜电位（ΔΨm）下降；透射电镜显示线粒体嵴紊乱、肿胀；COX-IV表达和ATP水平下降。而H11细胞ROS水平降低，线粒体膜电位维持，线粒体超微结构改善，COX-IV和ATP水平恢复，说明hTERT部分恢复线粒体完整性和生物能量功能。
2.6 来自衰老和hTERT-UCMSCs的sEVs对炎症的差异调节：通过Western blot、TEM和NTA确认sEVs特征后，在LPS刺激的BMDM中，P7-sEVs和H11-sEVs均能促进M2极化（F4/80+CD206+CD11c?巨噬细胞比例增加），抑制iNOS表达和NO产生，而P11-sEVs此能力减弱。miRNA筛选发现miR-217-5p在P11-sEVs中富集，H11-sEVs中接近年轻水平；用antagomir-217-5p处理P11-sEVs可恢复其抗炎作用并上调受体巨噬细胞中SIRT1的表达。P11-sEVs下调SIRT1，而H11-sEVs维持SIRT1水平，表明衰老通过miR-217-5p/SIRT1轴损害sEV免疫调节功能，而hTERT挽救可保留该功能。
2.7 不同来源sEVs对原始卵泡激活和卵巢保护活性的相似作用：在新生小鼠卵巢体外培养模型中，三种sEVs均能促进原始卵泡激活，表现为FOXO3a从卵母细胞核转位至细胞质；Western blot显示Akt、mTOR和核糖体蛋白S6磷酸化均增加，且雷帕霉素可阻断该激活，证实依赖PI3K/mTOR通路。在10月龄ICR小鼠体内，所有sEVs均增加PCNA阳性生长卵泡、减少凋亡并改善卵母细胞线粒体膜电位；但P11-sEVs在减轻卵巢纤维化方面作用较弱，而H11-sEVs与年轻P7-sEVs效果相当，表现出年轻样卵巢保护活性。
2.8 hTERT保留类似年轻的sEV蛋白谱：蛋白质组学主成分分析显示三组sEV蛋白谱明显分离。Venn分析鉴定出1422个差异表达蛋白（DEPs），其中1169个在P7-sEVs和H11-sEVs中表达趋势一致、在P11-sEVs中相反；功能富集分析显示，P11-sEVs下调蛋白富集于免疫系统过程负调控、白细胞和淋巴细胞活化负调控、细胞因子产生负调控等抗炎过程，而上调蛋白富集于氧化应激反应、炎症反应等促炎过程。此外，PI3K-Akt通路相关蛋白在三组sEVs中均广泛保留，与其共同的原始卵泡激活能力一致。
讨论部分指出，MSC疗法的临床转化长期受限于细胞衰老和异质性。hTERT永生化可克服原代MSC增殖能力有限的问题，且不诱导致瘤性，同时保持细胞表面标志和分化能力，为标准化生产sEVs提供了可靠平台。机制上，miR-217-5p是影响衰老sEV免疫调节功能的重要货物分子，但sEV功能可能由多种组分协同决定，未来需结合miRNA和脂质组学进一步解析。研究结论为：该研究确立了hTERT-UCMSCs作为标准化生产具有生物活性sEVs的有前景平台，并为其再生和免疫调节潜力提供了机制见解。
