《Ecology and Evolution》：Mitochondrial Genome Sequencing and Phylogenetic Analysis of Myotis pequinius and M. chinensis
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本研究首次对北京鼠耳蝠（*Myotis pequinius*）和中华鼠耳蝠（*M. chinensis*）的线粒体基因组（mitochondrial genome）进行了测序和分析。结果表明，北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠的线粒体基因组分别为17,395 bp和17,
本研究首次对北京鼠耳蝠（*Myotis pequinius*）和中华鼠耳蝠（*M. chinensis*）的线粒体基因组（mitochondrial genome）进行了测序和分析。结果表明，北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠的线粒体基因组分别为17,395 bp和17,014 bp。两个基因组均呈现典型的哺乳动物线粒体组成，包括13个蛋白编码基因（protein-coding genes, PCGs）、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区（displacement loop），并具有明显的AT偏好。基于13个蛋白编码基因构建的系统发育树（phylogenetic tree）显示，北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠在遗传上彼此接近，并与*Myotis bombinus*、*M. nattereri*、*M. myotis*和*M. blythii*聚为一个高支持度的独立分支。本研究填补了这两种中国蝙蝠物种的线粒体基因组数据空白，为解决鼠耳蝠属（*Myotis*）的分类争议提供了基础分子资源，并为当地蝙蝠种群的生物多样性保护和种群遗传研究提供了有价值的遗传参考。
**论文解读：北京鼠耳蝠与中华鼠耳蝠线粒体基因组测序及系统发育分析**
**研究背景与问题**
现代分子生物学的发展使基于分子数据的物种进化分析成为热点。线粒体基因组（mitochondrial genome, mitogenome）因其母系遗传、进化速率快、结构相对简单，成为研究哺乳动物系统发育关系的理想工具。其中，13个蛋白编码基因（protein-coding genes, PCGs）的协同进化模式可为系统发育重建提供高分辨率信息，广泛用于物种起源、系统发育关系和遗传多样性研究。鼠耳蝠属（*Myotis*）属于翼手目（Chiroptera）蝙蝠科（Vespertilionidae），是全球分布最广、物种多样性最丰富的陆生脊椎动物类群之一，生态位极其多样。准确的物种鉴定是理解生物多样性和开展进化研究的关键基础。然而，早期分类主要依赖形态特征，将鼠耳蝠属分为三至七亚属，但形态特征的相似性可能源于对相似生态位的趋同适应，难以准确反映系统发育关系。近年来，Guan等基于219个线粒体基因组（覆盖187种蝙蝠，含54个新测序）和200个核基因直系同源序列系统阐明了翼手目内的系统发育关系，但线粒体基因组在鼠耳蝠属中单独使用时需谨慎，因为该属中广泛存在线粒体基因渗入、不完全谱系分选和线粒体-核基因不一致等现象。Platt等对37个代表性鼠耳蝠物种测序发现，所有由核基因保守元件（ultraconserved elements, UCEs）生成的294个系统发育树均与基于线粒体基因组推断的树显著不同，约一半UCE位点与估计的物种树冲突。这表明线粒体基因组可能与随机选取的单个核基因位点一样，不一定反映真实物种树，谱系分选、网状进化和基因渗入可能影响了鼠耳蝠属的基因组。然而，NCBI数据库目前仅包含36个鼠耳蝠属线粒体基因组，信息覆盖不足，严重限制了该属特别是中国物种的系统发育研究。北京鼠耳蝠（*Myotis pequinius*）是中国特有物种，目前仅知分布于北京、河北、陕西、四川、河南、安徽、江苏和山东，具有明显的地理限制和栖息地特异性；中华鼠耳蝠（*M. chinensis*）虽广泛分布于中国南方大部分地区，但两者的线粒体基因组数据完全缺失。这一缺陷使中国鼠耳蝠属的系统发育框架缺乏坚实数据支持，导致分类边界模糊，亟需系统性的分子研究。
**研究内容与结论**
本研究对北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠的线粒体基因组进行了测序和注释，系统分析了其结构特征和密码子使用偏好。在此基础上，结合NCBI数据库中已有的鼠耳蝠属线粒体基因组数据，利用最大似然法（maximum likelihood, ML）构建系统发育树，初步探讨了这两个物种的线粒体谱系关系，并为其未来整合分类学研究提供了基础线粒体基因组数据。需强调的是，本研究呈现的系统发育结果代表线粒体基因树（gene tree），不等同于物种树（species tree），需用核标记进行验证才能得出稳健的分类学结论。研究结果不仅为中国鼠耳蝠属未来的分类修订提供了宝贵的线粒体基因组资源，还为该属物种的生物多样性保护、系统进化研究和遗传资源管理提供了重要科学参考。论文发表在《Ecology and Evolution》。
**主要关键技术方法**
样本来源：北京鼠耳蝠采集自中国山西省灵丘县，中华鼠耳蝠采集自河南省商城县，均为成年雄性个体。采用试剂盒提取翼膜组织基因组DNA，经高通量测序（DNBSEQ-T7平台）后，使用Fastp过滤和去重，FastQC进行质量评估，GetOrganelle软件组装线粒体基因组，MitoZ软件进行注释。通过bwa将测序数据比对至最终线粒体基因组序列以验证。**序列分析**：使用在线工具计算碱基组成、AT/GC偏斜（AT-Skew, GC-Skew）；DnaSP v5计算相对同义密码子使用频率（relative synonymous codon usage, RSCU）和Ka/Ks比值（非同义替换频率与同义替换频率之比）以评估选择压力；MITOS在线工具预测tRNA二级结构，ViennaRNA网站可视化；D-loop区结构特征参考已报道蝙蝠D-loop结构。**系统发育分析**：从NCBI下载34个鼠耳蝠属物种线粒体基因组，以白腹管鼻蝠（*Murina leucogaster*）和姬蝠（*Kerivoula minuta*）作为外群，将13个PCGs串联后使用Geneious Pro 4.8.2比对，MEGA 11.0确定最佳核苷酸替换模型为GTR+G+I，在CIPRES平台使用RAxML-HPC BlackBox v8.1.24构建ML树，1000次自举检验。
**研究结果**
**3.1 线粒体基因组结构与碱基组成**
通过全基因组组装与注释获得：中华鼠耳蝠线粒体基因组全长17,014 bp，北京鼠耳蝠为17,395 bp，均为典型双链环状分子，结构及基因排列与已报道蝙蝠线粒体基因组一致，包含13个PCGs、22个tRNA、2个rRNA和一个D-loop区。8个tRNA（trnS2, trnE, trnP, trnQ, trnA, trnN, trnC, trnY）和ND6由轻链编码，其余基因位于重链。最长基因ND5为1,821 bp，ATP8与ATP6之间重叠最长（-43 bp），基因间隔区1-32 bp，最长的间隔在trnN和trnC之间（32 bp）。北京鼠耳蝠中s-rRNA和l-rRNA长度分别为970 bp和1,568 bp，中华鼠耳蝠中分别为975 bp和1,562 bp。碱基组成分析显示，两个物种各功能区域均维持AT偏倚，但不同区域偏倚存在差异：北京鼠耳蝠PCGs区A+T含量64.98%，AT-Skew接近零（-0.01），碱基使用最平衡；tRNA区A+T含量65.80%，AT-Skew 0.01，GC-Skew 0.09（唯一弱正GC偏倚）；rRNA区A+T含量64.30%，16S rRNA（66.14%）高于12S rRNA（61.34%），两者均呈正AT-Skew；D-loop区A+T含量最低（60.43%），GC-Skew -0.24，体现C高于G的整体偏倚。中华鼠耳蝠各区域碱基组成整体类似，但存在显著差异：PCGs区A+T含量65.31%，AT-Skew 0.02（弱正），与北京鼠耳蝠相反；tRNA区A+T含量63.24%（低A+T区），GC-Skew -0.12（负值）；D-loop区G+C含量最高（67.82%），GC-Skew -0.29，C偏倚程度更高。
**3.2 蛋白编码基因与密码子使用模式**
两个物种13个PCGs总长均为11,440 bp，占线粒体基因组全长的65.77%（北京鼠耳蝠）和67.23%（中华鼠耳蝠）。除ND6由轻链编码外，其余PCGs由重链编码。起始密码子中，除ND3、ND5、ND2分别使用ATA、ATA、ATT外，其余10个基因均使用ATG；终止密码子多样：COX1、COX2、ATP8、ATP6、ND4L、ND5、ND6、ND1使用TAA，COX3、ND3、ND2使用TAG，ND4使用ACT（可能通过转录后多聚腺苷酸化形成完整TAA），CYTB终止密码子在两个物种中不同（北京鼠耳蝠为AGA，中华鼠耳蝠为TAA）。密码子使用偏好分析：北京鼠耳蝠偏好以A或U结尾的密码子，最高频密码子为GGA（Gly, RSCU=1.96），其他高频密码子如CUA（Leu, 1.83）、GUA（Val, 1.81）、CAA（Gln, 1.79）、CCU（Pro, 1.76）均以A或U结尾；最低频密码子为GCU（Ala, RSCU=0.06）。中华鼠耳蝠中，GUA（Val）为最偏好密码子（RSCU=2.11），其他高频密码子包括CUA（Leu, 2.04）、CGA（Arg, 1.87）、GGA（Gly, 1.86）；最低频密码子为CCG（Pro, RSCU=0.05）。两个物种密码子模式差异可能源于突变压力和自然选择长期作用。Ka/Ks比值分析：所有PCGs的Ka/Ks均严格小于1.0（范围0.01-0.85），表明这些基因主要受纯化选择（purifying selection）作用。其中ATP8、ND1和ND6在部分配对比较中Ka/Ks比值相对较高（常超过0.5），显示这些基因受纯化选择较弱。
**3.3 rRNA、tRNA与D-loop**
两个物种均含22个tRNA基因，总长分别为北京鼠耳蝠1,509 bp，中华鼠耳蝠1,507 bp，长度范围59 bp（trnS2）至75 bp（trnL1）。大多数tRNA可折叠成标准三叶草结构，但两个物种的trnS1基因均缺失DHU臂。两个物种各有2个rRNA基因：12S rRNA（北京鼠耳蝠970 bp，中华鼠耳蝠975 bp）位于trnF和trnV之间，16S rRNA（北京鼠耳蝠1,566 bp，中华鼠耳蝠1,562 bp）位于trnV和trnL1之间。
**3.4 系统发育树**
基于13个PCGs串联序列构建的最大似然（ML）系统发育树显示，所有鼠耳蝠属物种形成单系群，主要分为两大支。Clade I（自举值100%）包含欧亚物种，包括*Myotis bombinus*、*M. nattereri*、*M. myotis*、*M. blythii*以及亲缘关系密切的北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠。北京鼠耳蝠与*M. bombinus*紧密聚类（自举支持100%），表明它们可能共享共同祖先。北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠位于高支持度的独立分支内（共享祖先节点支持值79%），并与*M. bombinus*、*M. nattereri*、*M. myotis*、*M. blythii*等形成独立进化枝。Clade II（自举值100%）包含其余物种，主要分布于美洲和东亚。这一深部分支与基于线粒体和核标记的先前分子系统发育研究一致。
**讨论与结论**
讨论部分指出：本研究成功组装并注释了北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠的线粒体基因组，其长度、基因组成、基因顺序和整体结构与其他翼手目物种相似，均呈现典型AT偏倚，13个PCGs的长度、结构和编码链分布也大致相当，反映了翼手目线粒体基因组在进化中的高度保守性。除trnS1外所有tRNA均呈典型三叶草二级结构，trnS1缺失DHU臂是后生动物线粒体基因组的保守特征。密码子使用分析显示两者偏好A或U结尾的密码子，但最优密码子不同：北京鼠耳蝠偏好GGA，中华鼠耳蝠偏好GUA，这种差异可能与物种特异性基因表达效率有关，间接反映分子水平的适应性分化。Ka/Ks比值均低于1，表明纯化选择是主导进化力量，但ATP8、ND1和ND6比值相对较高（某些配对比较中超过0.5），表明这三个基因受纯化选择较弱，可能与呼吸链复合体中的外围位置或辅助功能有关，允许更高的氨基酸变异容忍度。系统发育树将鼠耳蝠属分为两大支，北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠位于Clade I（欧亚支），与*M. bombinus*、*M. nattereri*等紧密聚类。研究局限性包括：仅基于线粒体数据（母系遗传，单一遗传位点），核基因可能提供额外分辨率；线粒体标记易受基因渗入、不完全谱系分选和线粒体-核基因不一致影响，不能单独用于物种级分类推断；密码子使用差异和tRNA结构变异的功能意义需实验验证；ND1谱系特异性纯化选择放松需更大样本检验。未来需结合群体基因组学（如全基因组SNP数据和全基因组重测序）来厘清鼠耳蝠属复杂进化历史。
**研究结论翻译**：
总之，本研究首次报道了北京鼠耳蝠和中华鼠耳蝠的完整线粒体基因组，表征了其结构特征和分子变异，并在系统发育框架内提供了这些物种的线粒体基因树。这些发现可能促进鼠耳蝠属的系统发育研究，并为相关物种的保护策略制定提供必要的进化背景信息。
