《Ecology and Evolution》：Wolves in Bhutan Are Part of the Ancient Himalayan Wolf (Canis lupus chanco) Lineage
编辑推荐：
南亚分布有三个狼谱系，包括栖息于高喜马拉雅及青藏高原的喜马拉雅狼（Canis lupus chanco）、分布于印度次大陆的印度狼（Canis lupus pallipes），以及由多个灰狼（Canis lupus）亚种代表、见于中亚毗邻区域的全北界灰狼。喜马
南亚分布有三个狼谱系，包括栖息于高喜马拉雅及青藏高原的喜马拉雅狼（Canis lupus chanco）、分布于印度次大陆的印度狼（Canis lupus pallipes），以及由多个灰狼（Canis lupus）亚种代表、见于中亚毗邻区域的全北界灰狼。喜马拉雅狼是演化上独特的高海拔狼谱系，但东喜马拉雅（含不丹）遗传信息稀缺，构成关键知识缺口。在不丹全国雪豹调查（2022–2023）期间，研究人员采集了疑似雪豹粪便，经遗传学确认其中一部分为灰狼（C. lupus）。研究人员从13份样本（吉格梅·多吉国家公园n=1；旺楚克百年国家公园n=12）提取DNA，扩增线粒体控制区（D-loop）与细胞色素b序列。系统发育分析将所有不丹序列归入单系喜马拉雅狼支系，中位连接单倍型网络提供一致支持。所有检出单倍型均与既往尼泊尔西北部报道匹配，表明不丹狼落入已知喜马拉雅狼mtDNA支系。结果为不丹存在喜马拉雅狼谱系提供首份遗传证据，并对mtDNA多样性作初步评估。在不丹全境扩大非损伤采样（含有狼记录但缺遗传代表的区域，如吉格梅·凯萨尔严格自然保护区与帕罗林业局辖区），结合个体识别与核标记，方能量化遗传多样性与种群连通性，并给出首批种群规模估计。此类采样对评估精细种群结构及指导这一高亚洲特有受胁狼谱系的国家保护规划至为关键。
研究背景方面，喜马拉雅狼（Canis lupus chanco）是高喜马拉雅与青藏高原的顶级捕食者，IUCN红色名录列为易危（Vulnerable），被公认为亚洲演化最古老且独特的狼谱系之一，其线粒体DNA（mtDNA）与核标记均显示该谱系位于广布狼-狗（全北界灰狼/家犬）复合体基部，分化时间可追溯至数十万年前，并携带缺氧通路相关核单核苷酸多态性（SNP）及性染色体标记等功能适应。不丹位于该谱系分布区东南缘，此前仅西邻锡金狼群获遗传确认属喜马拉雅狼，北部经高海拔山口与西藏、尼泊尔雪豹存在基因流，但不丹境内狼的亚种身份从未经定向遗传采样与系统地理评估。不丹狼是该国最少研究的大型食肉动物，仅知分布于旺楚克百年国家公园（WCNP）、吉格梅·多吉国家公园（JDNP）、吉格梅·凯萨尔严格自然保护区（JKSNR）及帕罗林业局（PFD），相机陷阱副捕获显示其可能仅占国土不足7%，且缺乏专门研究计划。因此，借助2022–2023年全国雪豹调查所获疑似雪豹粪便中遗传学判定为灰狼的样本，研究人员首次对不丹狼mtDNA谱系进行描述，以明确其分类归属并初步评估mtDNA多样性。该研究发表于《Ecology and Evolution》。
关键技术方法上，研究人员依托不丹第二次全国雪豹调查（2022–2023）在海拔3400–5200 m沿2 km×2 km网格布设相机陷阱并行采集184份疑似雪豹粪便，硅胶干燥保存后送美国杜肯大学遗传学实验室；先以线粒体12S rRNA（MT-RNR1）宏条形码初筛，对24份Canis属粪便加做242 bp控制区（D-loop）与508 bp细胞色素b扩增及Illumina MiSeq测序，细胞色素b阳性样本辅以Sanger测序补平；序列以CLCBio/CLC Genomic Workbench质控拼接，比对喜马拉雅狼参考序列（KY996534、NC_010340）并BLAST判定；单倍型以R包pegas/ape界定，系统发育用IQ-TREE v2最大似然法（模型TPM2u+F+G4与K2P+G4）构建，单倍型网络用PopART中位连接法，遗传多样性计算Nei无偏单倍型多样性（Hd）与核苷酸多样性（π），个体推定采用同单倍型且采样点间距<50 km规则。
研究结果部分，3.1遗传多样性中，13份狼粪（JDNP 1份、WCNP 12份）成功扩增，D-loop可用12份、细胞色素b可用11份；细胞色素b无变异（Hd=0），全部匹配尼泊尔上胡姆拉已知单倍型（KY996533）；D-loop检出两单倍型——Himalayan wolf D-loop 2（KY996530，5份，含JDNP唯一样本）与HW9_Museum Nepal（AY333738，7份），D-loop单倍型多样性Hd=0.5303，平均核苷酸差异5.36%；按距离规则推定为5个疑似个体。3.2系统地理中，细胞色素b最大似然树将不丹样本与西藏、尼泊尔喜马拉雅狼聚为强支持支系，明显脱离全北界灰狼与印度狼；D-loop树虽浅节点支持略低但拓扑一致，不丹序列归入喜马拉雅狼簇并与青藏、尼泊尔、青海样本聚类；中位连接网络进一步显示所有粪便序列落入喜马拉雅狼集群，WCNP内两单倍型并存且D-loop2跨两公园共享，细胞色素b网络仅恢复文献中两喜马拉雅狼单倍型之一即不丹匹配型，其位置介于狼单倍型与土狼-藏狐祖先节点间，符合犬科基部分裂格局。
讨论部分总结，mtDNA证据确证不丹高海拔狼属喜马拉雅狼单系支系，单倍型组成（细胞色素b完全保守、D-loop两单倍型）与尼泊尔西北部已知mtDNA池一致，提示母系连续性与沿喜马拉雅扩散连通；未检出新单倍型源于样本量小（JDNP仅1份）、空间偏倚、粪便可能重复抽样同一体及短片段分辨率有限，与尼泊尔、印度同尺度短片段研究低单倍型丰富度规律吻合；不丹WCNP-JDNP间及JDNP-JKSNR间适宜生境表观断裂需核标记与实地验证，不能由当前数据判定为隔离屏障；作者主张扩大JKSNR、PFD及间隙带非损伤采样，整合核基因分型（个体识别与基因流）、冲突评估与跨境（阿鲁纳恰尔邦塔旺、西藏相邻高原）比对，以建立国家遗传基线、判别保护单元与迁徙廊道。结论译文：本研究mtDNA结果表明不丹狼隶属喜马拉雅狼谱系；来自两保护区的13份扩增粪便中D-loop（n=12）与细胞色素b（n=11）序列聚于喜马拉雅狼单系支系，单倍型网络一致支持该归位，首次提供不丹存在该谱系的遗传证据并初步描述mtDNA多样性；但需核标记深化系统地理与种群状态评估。
