功能性超声成像揭示巴顿病小鼠模型中枢视觉通路的早期通路特异性重组

《Neurobiology of Disease》：Functional ultrasound imaging reveals early pathway-specific reorganization of central visual circuits in a mouse model of Batten disease

　　

CLN3病（即青少年巴顿病）是一种神经退行性溶酶体贮积症，其中视觉障碍通常是其最早的临床表现。尽管视网膜病理已被广泛研究，但中枢视觉通路内的功能改变仍知之甚少。在此，研究人员使用功能性超声（fUS）成像来表征在严重视网膜变性发生前年轻Cln3敲除（Cln3^?/?）小鼠中枢视觉通路中的视觉诱发活动。在涵盖膝状体-纹状体通路和膝状体外通路的区域（包括皮质、丘脑和中脑区域）中定量了视觉诱发的血流动力学反应。通过线粒体ATP合酶亚基c（SCMAS）的免疫组化定量评估了区域病理负荷，SCMAS是CLN3病的标志性病理标志。与野生型对照相比，年轻Cln3^?/?小鼠表现出视觉诱发反应的通路特异性重组，即膝状体外通路（包括中脑、后丘脑和前次级视觉皮质）中fUS激活增强，而膝状体-纹状体通路中前丘脑的激活减弱，视觉皮质的激活则保留。所有检查的视觉区域中SCMAS积累均增加，但膝状体-纹状体区域的积累大于膝状体外区域，表明存在差异性的区域易损性。综上所述，这些发现揭示了在明显神经退行性变之前中枢视觉通路的早期通路特异性重组，并将fUS成像与定量组织病理学相结合，确立为一种用于CLN3病及相关溶酶体贮积症中枢神经系统功能障碍早期检测和纵向监测的有前景的方法。

**论文解读：功能性超声成像揭示巴顿病小鼠模型中枢视觉通路的早期通路特异性重组**

**研究背景与问题**

巴顿病（Batten disease），由CLN3基因突变引起，是一种罕见的神经退行性溶酶体贮积症，以神经元溶酶体内自荧光贮积物的渐进性积累为特征。视觉障碍通常是其最早的临床表现，随后出现认知下降、运动功能障碍、癫痫活动、听觉感知障碍和语言障碍。受影响的4至8岁儿童通常经历视力、颜色辨别和对比敏感度的渐进性下降，常伴有畏光和眼球震颤。由于视觉症状出现早且进展迅速，表征视觉通路的功能反应对于理解疾病机制以及开发和评估靶向治疗策略至关重要。

视觉处理的神经架构为解释CLN3病中观察到的视觉缺陷提供了机制框架。膝状体-纹状体通路（geniculostriate pathway）支持形状、颜色和空间信息的有意识感知；而膝状体外通路（extrageniculate pathway）则支持视觉运动协调、视觉空间定向和反射性视觉行为。尽管CLN3病的临床表现常从眼部病理角度研究，但中枢视觉通路对疾病相关视觉功能障碍的贡献仍知之甚少。虽然已在CLN3人类组织和动物模型中鉴定出皮质和皮质下脑区域的溶酶体贮积积累和神经元丢失，但尚不清楚中枢视觉通路的功能异常是否在明显神经退行性变之前出现。这一问题尤为重要，因为在年轻Cln3小鼠模型中，视网膜功能在早期疾病阶段似乎相对保留，电视网膜图缺陷仅在较晚年龄（约1岁）才变得明显。在其他神经退行性和眼科疾病中，功能成像研究已显示外侧膝状体（LGN）和初级视觉皮质（V1）的异常与颜色辨别和对比敏感度受损相关。鉴于CLN3病呈现类似的视觉缺陷，评估中枢视觉通路内的视觉诱发活动可能揭示与疾病进展相关的早期环路水平功能障碍。此外，偏头痛研究提示膝状体外通路参与畏光产生和光诱导头痛。重要的是，畏光已被报道为CLN3病的早期临床特征，且常是眼科评估中的主要主诉。这些观察促使研究人员对早期Cln3^?/?小鼠的膝状体-纹状体通路和膝状体外通路进行通路水平分析。实现这一目标需要一种能够评估分布式视觉网络功能的成像模态。

功能性超声（fUS）成像是一种神经成像技术，以高空间和时间分辨率测量刺激诱发的脑血流变化。通过将近显微空间分辨率与足以同时成像皮质和皮质下结构的穿透深度相结合，fUS能够实现跨分布式神经环路的全脑功能映射。这些特性使得fUS特别适合研究小鼠大脑中平行的视觉通路，因为使用传统光学成像方法难以捕捉丘脑、中脑和皮质区域之间的功能交互。

**研究内容与结论**

在本次研究中，研究人员使用fUS成像检查了年轻成年（3月龄）Cln3^?/?小鼠跨平行中枢视觉通路的视觉诱发反应。与野生型（WT）对照相比，研究人员观察到沿膝状体外通路区域激活增强，而膝状体-纹状体通路内反应减弱或不变。为了建立这些功能变化的病理背景，研究人员定量了视觉区域中线粒体ATP合酶亚基c（SCMAS）的积累，并发现了区域依赖的贮积负荷差异。这些发现共同证明了CLN3病中平行中枢视觉通路跨区域的早期通路特异性功能改变，并揭示了可能有助于视觉环路功能改变的差异性区域易损性。这些发现为理解巴顿病早期阶段中枢视觉网络的通路特异性重组奠定了基础，并将fUS确立为在神经退行性疾病中检测早期环路水平功能障碍的敏感方法。该论文发表在《Neurobiology of Disease》。

**主要关键技术方法**

研究人员使用了来自Jackson Laboratory的Cln3^?/?小鼠和年龄匹配的野生型（WT）同窝对照，均为12-14周龄。fUS成像采用可编程超快超声扫描仪（Vantage 128, Verasonics Inc.）配备L22-14vX线性阵列换能器，通过完整的颅骨进行经颅成像。视觉刺激包括正弦亮度光栅（空间周期约0.13 cycles/度，2 Hz闪烁，10秒刺激，15秒恢复，重复10次）。超声信号处理采用奇异值分解（SVD）时空滤波，激活图通过将刺激时间序列与标准血流动力学响应函数（HRF）卷积后计算Pearson相关系数，并应用Z-score阈值（>3.1）和连通分量过滤（>0.10 mm×0.10 mm）生成。图像注册到Allen小鼠脑共同坐标框架（CCFv3）。免疫组织化学使用抗SCMAS抗体（1:250, ab181243, Abcam）对80 μm冠状切片进行染色，并通过Sauvola自适应阈值法量化SCMAS⁺面积每细胞。

**研究结果**

**3.1. WT小鼠在视觉区域显示刺激诱发的fUS激活：** 通过检查3月龄WT小鼠跨主要视觉通路成分的冠状平面，研究人员验证了fUS检测刺激诱发活动的可靠性。在Bregma ?2.00 mm，在LP和LGN观察到清晰、空间定位的激活。在Bregma ?3.00 mm，激活模式空间异质性更大，在V1和SC检测到可重复的反应，伴有AL和PM中较弱且弥散的激活。在Bregma ?3.40 mm，在V1和SC均观察到明显且空间一致的激活。这些激活模式在动物间可重复，且与已知视觉通路结构解剖学对齐，为后续比较提供了稳定参考。

**3.2. Cln3^?/?小鼠在多个视觉区域显示改变的fUS激活：** 通过比较Cln3^?/?和WT小鼠在视觉丘脑、皮质和中脑区域的激活，研究人员发现丘脑前部（aTH，包括LGN和aLP）平均Z-score显著降低（p=0.0321），表明反应减弱；而丘脑后部（pTH）激活像素百分比显著增加（p=0.0370）。在视觉皮质中，前部区域（aPM和AL）的激活像素百分比在Cln3^?/?小鼠中显著升高（aPM: p=0.0254, AL: p=0.0303），后部皮质区域无显著变化。在中脑，前部中脑（aMB）的激活像素百分比在Cln3^?/?小鼠中显著增加（p=0.0358），后部中脑无显著差异。

**3.3. Cln3^?/?小鼠中SCMAS积累的区域特异性差异：** 通过免疫组化定量SCMAS表达，研究人员发现所有视觉区域中Cln3^?/?小鼠的SCMAS⁺面积每细胞均显著高于WT。在视觉丘脑内，aTH的SCMAS积累显著高于pTH（p<0.0001）。在视觉皮质，V1（aV1和pV1）的SCMAS积累显著高于V2（aV2和pV2）（所有p<0.001），而V1或V2内部无前后差异。在中脑，aMB的SCMAS积累显著高于pMB（p<0.0001），但整体SCMAS水平低于丘脑和皮质区域。

**3.4. fUS激活与SCMAS积累的通路特异性关系：** 按照膝状体-纹状体通路和膝状体外通路组织划分，研究人员发现Cln3^?/?小鼠在膝状体-纹状体通路中aTH激活减弱，而V1和pV2无显著变化；在膝状体外通路中，中脑、pTH和aV2激活增强。SCMAS积累在膝状体-纹状体区域（如V1）高于膝状体外区域，中脑的病理负荷最低。混合效应分析显示，在膝状体外通路中，激活像素百分比的基因型主效应显著（p=0.0030），且Tukey多重比较表明pTH、aPM和AL的激活程度增加（调整后p分别为0.0497、0.0356和0.0460），aMB呈趋势（p=0.0727）。在膝状体-纹状体通路中，平均Z-score的Tukey比较显示aTH激活显著降低（p=0.0321）。性别作为固定效应纳入时，未发现显著的主效应或交互作用。

**总结讨论与结论**

**讨论部分：** 研究人员的主要发现是早期CLN3病与明显神经退行性变之前中枢视觉通路跨区域的视觉诱发活动通路特异性重组相关。膝状体-纹状体通路（LGN/aLP）中激活减弱，而膝状体外通路（SC-pLP-aV2）中激活增强，提示平行视觉环路之间的视觉诱发活动重新分配。SCMAS负荷在膝状体-纹状体区域更大，表明这些区域更易受早期CLN3病理影响，而相对保留的中脑、pLP和aV2则表现出增强的激活。这些发现揭示了早期疾病中中枢视觉处理的通路特异性重组。此外，增强的膝状体外通路激活与偏头痛中涉及畏光的区域重叠，提示类似环路机制可能参与CLN3病的畏光症状。fUS成像结合组织病理学评估能够在早期检测中枢视觉功能障碍，因为视网膜功能在3月龄Cln3^?/?小鼠中仍大致保留。fUS提供纵向监测疾病进展的平台，并可能作为治疗评估的转化成像生物标志物。方法学考虑包括经颅成像、轻麻醉方案（地托咪定/异氟烷）和HRF建模的使用。局限性包括fUS测量神经血管反应而非直接神经元活动、空间分辨率对小核团注册误差敏感以及仅使用单一视觉刺激范式。

**结论部分翻译：** 本研究使用功能性超声成像证明了年轻Cln3^?/?小鼠中枢视觉通路的早期通路特异性功能重组。膝状体-纹状体通路内激活减弱，同时膝状体外环路中激活增强，与SCMAS积累的区域差异相关，表明平行视觉通路在早期CLN3病期间存在差异性易损性。通过将全脑功能成像与定量组织病理学相结合，本工作识别了在明显神经退行性变之前出现的早期环路水平功能障碍，并将fUS确立为一种用于检测和纵向监测CLN3病中枢神经系统功能障碍的有前景的方法。更广泛地，该框架可能促进CLN3病及其他溶酶体贮积症的功能生物标志物开发和治疗干预评估。