《Toxicology in Vitro》：A modified nonradioactive screening assay for MCT8 disruptors based on UV and ammonium persulfate-mediated iodide release from thyroid hormone
编辑推荐：
•低强度紫外线在驱动 T3 摄取试验中激素的 APS 介导降解方面等效于热量。•优化的 UV/APS MCT8 试验方法更快，并避免了热介导 APS 方法中出现的蒸发和实验室器皿降解等问题。•改良后的试验在正确表征 MCT8 抑制剂方面具有与原方法相同的灵敏度。引言甲状腺激素
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低强度紫外线在驱动 T3 摄取试验中激素的 APS 介导降解方面等效于热量。
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优化的 UV/APS MCT8 试验方法更快，并避免了热介导 APS 方法中出现的蒸发和实验室器皿降解等问题。
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改良后的试验在正确表征 MCT8 抑制剂方面具有与原方法相同的灵敏度。
引言
甲状腺激素（TH）对于许多器官的正常功能以及人类健康的生长发育至关重要。即使在发育的关键敏感时期（产前或产后），TH 的产生或作用受到轻微或暂时的干扰，也可能导致脑结构永久改变、智力和感知能力终身下降（Ghassabian 等人，2014 年；Hassan 等人，2017 年；Korevaar 等人，2016 年；Samadi 等人，2015 年），增加自闭症谱系障碍的风险（Kaplan 等人，2024 年）以及，可能，注意力缺陷/多动障碍（Panagiotou 等人，2022 年）。
TH 完全通过多步过程在甲状腺中合成。碘化物首先通过钠 - 碘同向转运体（NIS）被甲状腺上皮细胞摄取并转运到胶质中（De la Vieja 和 Santisteban，2018 年）。在那里，甲状腺过氧化物酶（TPO）在过氧化氢存在下氧化碘化物并催化其掺入甲状腺球蛋白的酪氨酸残基中（Dunn 和 Dunn，2001 年）。这些碘化酪氨酸的偶联生成了碘甲状腺氨酸结构，当碘化甲状腺球蛋白通过蛋白水解降解释放时，它们就变成了甲状腺素（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）（Vassart 和 Dumont，1992 年）。循环中的 TH 通过下丘脑 - 垂体 - 甲状腺（HPT）轴中的负反馈回路进行调节（Chiamolera 和 Wondisford，2009 年）。在循环系统中，TH 主要与载体蛋白结合，包括甲状腺素结合球蛋白（TBG）、转甲状腺素蛋白（TTR）和白蛋白，这些蛋白调节其生物利用度和分布（Schussler，2000 年；Richardson，2009 年）。循环 TH 向发育中大脑的递送是通过一系列严格调节的生理过程来协调的。在妊娠早期，母体 TH 合成占主导地位，而胎儿 TH 产生在后期阶段变得显著（Forhead 和 Fowden，2014 年；Morreale de Escobar 等人，2004 年）。TH 跨胎盘屏障和血脑屏障的转运由特定的跨膜转运体介导，特别是单羧酸转运蛋白 8（MCT8）、有机阴离子转运多肽 1C1（OATP1C1），以及可能其他具有重叠功能的转运体（Heuer 和 Visser，2009 年；Bernal 等人，2015 年）。一旦进入中枢神经系统，TH 通过脱碘酶 DIO2 和 DIO3 进行局部代谢，它们分别将 T4 转化为具有生物活性的 T3 或无活性的代谢物。活性激素 T3 随后与核甲状腺激素受体（TRα和 TRβ）结合，启动转录程序，调节关键的神经发育过程，包括神经元分化、迁移、轴突生长、突触发生和髓鞘形成（Bernal，2017 年；Chan 和 Kilby，2000 年）。
上述任何步骤的破坏都会损害 TH 稳态，进而严重影响神经发育。许多环境化学物质已被证明或怀疑会干扰这些过程中的一个或多个过程。为了实现更快且更具成本效益的危害预测，同时减少对实验动物测试的依赖，美国 EPA、OECD 等监管机构正优先开发、验证和应用替代传统体内毒性研究的方法，用于化学品安全评估和基于风险的决策。这些工作的一个核心重点是推进快速的新方法（NAMs），以识别潜在的甲状腺干扰化学物质（TDCs）（Noyes 等人，2019 年）。人们已经做出了重大努力，开发针对甲状腺激素调节关键分子成分的高通量筛选试验——包括 NIS（Dong 等人，2019 年；Waltz 等人，2010 年）、TPO（Dong 等人，2020 年，Dong 等人，2024 年；Paul 等人，2014 年；Paul Friedman 等人，2016 年；Dong, H. 等人，2020 年；Schmutzler 等人，2007 年）、DIOs（Olker 等人，2018 年；Renko 等人，2015 年）、TH 受体（Freitas 等人，2011 年；Sun 等人，2012 年）、OATP1C1、TH 转运体 OAT4（Wagenaars 等人，2024a）以及 MCT8（Dong 和 Wade，2017 年；Jayarama-Naidu 等人，2015 年；Johannes 等人，2016 年；Rao 等人，1976 年）等。
MCT8 由 SLC16A2 基因编码，对于运输 TH 跨血脑屏障和血脑脊液屏障至关重要，使其对正常大脑发育和功能不可或缺（Bernal 等人，2015a）。MCT8 功能的破坏导致中枢神经系统（CNS）中 TH 可用性降低。无法表达功能性 MCT8 的个体患有先天性病症，与 T3（活性 TH）升高、T4（TH 前激素）低至正常以及非常严重的精神运动障碍有关。这种被称为阿伦 - 赫顿 - 达德利综合征（AHDS）的状况的严重程度，直接与突变型 MCT8 对 TH 运输受损的程度相关（Jansen 等人，2008 年）。一些化学物质已被证明能在体外阻断 MCT8 介导的 TH 摄取，包括溴磺酞（BSP）（Jayarama-Naidu 等人，2015 年）、水飞蓟亭（SC）和水飞蓟素（Johannes 等人，2016 年；Roth 等人，2010 年）。最近，在开发快速试验以筛选通过 MCT8 抑制损害 T3 摄取的化学物质方面取得了重大进展，这对于识别可能干扰 TH 信号的物质非常有价值（Dong 和 Wade，2017 年；Wagenaars 等人，2024b）。
最初评估 T3 或 T4 进入细胞的研究使用了放射性碘标记的 THs（Krenning 等人，1978 年；Rao 等人，1976 年；Topliss 等人，1989 年），包括几项专注于 MCT8 活性的研究（Braun 等人，2012 年；Kinne 等人，2010 年）。提出了一种非放射性试验方法（Braun 等人，2012 年；Jayarama-Naidu 等人，2015 年；Kinne 等人，2010 年）作为更便宜、更灵活的替代方案，并且随后证明适用于筛选 MCT8 抑制剂（Dong 和 Wade，2017 年；Johannes 等人，2016 年）。该试验通过测量过硫酸铵（APS）和热量氧化降解 T3 释放出的碘离子来定量细胞内 T3。自由碘随后可以通过碘介导的 Cerium4+ 到 Cerium3+ 的转化来定量，这被称为 Sandell Kolthoff (SK) 反应（Sandell 和 Kolthoff，1934 年）。T3 降解步骤是试验中潜在的可变性来源，因为将试验板在 90?°C 下加热 60 分钟对于可靠地从 T3 中释放碘至关重要，这会导致试验板和板密封膜的降解。最近的一项研究提出了一种替代方法，用 90 分钟的高强度紫外线照射代替 APS 和热量（Wagenaars 等人，2024b）。这种方法使用了一种定制工程仪器，配有 96 个高强度 UV LED 和大散热片。虽然这种方法非常有效，但这项技术并不广泛可用，对于无法获得熟练工程团队的实验室来说是一个障碍。
在本研究中，我们展示了一种 MCT8 试验方法，该方法结合使用低强度的商用紫外线灯和 APS 来实现 TH 降解。这种方法消除了对高温的需求，减少了消化时间，同时保持了相当的灵敏度。
章节摘要
化学品
试验中使用的所有化学品均为分析纯，购自 Millipore-Sigma-Aldrich 加拿大公司（Oakville, ON, Canada）。
用于从 T3 中释放碘化物的紫外设备
紫外线照射是使用宽光谱 UVB 灯泡（零件号：PL L36W FSUVB，由 LightSources, Inc., Dunakeszi, Hungary 制造）产生的，每个功率为 36 瓦，波长范围从 275 到 375?nm，在 310?nm 处有显著峰值。灯泡安装在商用光疗灯内 (Solarc Systems Inc.; Minesing, ON, Canada)。一个
光源的光谱强度
为了确认主要发射峰，在距离灯泡 20 cm 处对 200 到 1100?nm 的光发射强度进行了扫描（图 1A）。这次扫描确认了从 270?nm 开始增加的宽发射，在 312?nm 处达到尖锐最大值，在约 380?nm 处降至基线，在 364?nm 处有一个较小的峰值。在可见光范围内 405、435、545 和 580?nm 处也观察到了其他峰值。估算了距离灯泡 33?mm 处的辐照度 – 即在受照射试验板内的样品表面 – 用于
讨论
紫外线释放 TH 中碘化物的能力已被认识数十年（Sorimachi 和 Ui，1975 年）。多个碘化苯环吸收适当波长和强度的紫外线，导致碳 - 碘键断裂，随后碘化物从苯环释放。本研究建立在一篇最近发表的文章基础上，该文章利用这一原理在 MCT8 试验中使用了定制设备，在 295?nm 处提供高强度紫外线 (Wagenaars 等人，
CRediT 作者贡献声明
Hongyan Dong: 写作 – 原稿，调查，形式分析，数据管理。 Michael G. Wade: 写作 – 审查与编辑，监督，项目管理，方法论，资金获取，形式分析，概念化。
竞争利益声明
作者声明以下财务利益/个人关系，这可能被视为潜在竞争利益：Michael Wade 报告获得了加拿大卫生部的财政支持。如果有其他作者，他们声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文报告的工作。
致谢
作者感谢 Jason Zawalek 博士估算光强度，以及 Phil Shwed 博士和 Bhaja Krushna Padhi 博士对本手稿的有益评论。这些研究的资金由加拿大卫生部化学品管理计划研究倡议提供。
Hongyan Dong|Michael G. Wade
