基于RT-LAMP-CRISPR/Cas12a的核酸快速检测平台用于猪繁殖与呼吸综合征病毒2型诊断

《Veterinary and Animal Science》：Development of an RT-LAMP-CRISPR/Cas12a-Based Nucleic Acid Detection Platform for Rapid Diagnosis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Type 2

　　

摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）严重危害养猪生产，导致繁殖障碍和呼吸系统疾病。现有检测方法存在周转时间长、灵敏度与特异性不足、需专业人员操作及设备昂贵等局限，阻碍了其在快速现场诊断和早期疾病防控中的应用。本研究通过整合RT-LAMP引物的靶标特异性与CRISPR/Cas12a的双重识别能力，开发了一种新型检测平台。针对PRRSV-2结构蛋白M基因保守序列设计并筛选了最优crRNA，随后优化反应条件，并构建了含有靶基因的克隆载体。使用PCR、LAMP-CRISPR/Cas12a和qPCR进行灵敏度评价，结果显示对靶质粒DNA的检测限分别为9.17×10³ copies/μL、9.17×10^-1 copies/μL和9.17×10² copies/μL。值得注意的是，LAMP-CRISPR/Cas12a检测法表现出最高的灵敏度，其检测能力分别比PCR-CRISPR/Cas12a和qPCR高10⁴倍和10³倍。特异性分析表明，在四种受试猪病毒（包括PEDV G2b、PRV HNJY和PPV SD-1）中，仅HP-PRRSV产生阳性信号，其他病毒株未检测到荧光信号，表明不存在交叉反应。研究人员分析了50份猪血清样本，以比较RT-LAMP-CRISPR/Cas12a检测法与qPCR的诊断性能，结果显示两种方法的检测结果完全一致。所建立的RT-LAMP-CRISPR/Cas12a检测系统为PRRSV检测提供了一种快速、可靠的方法，并可能有助于改善PRRSV感染的监测与控制。

基于RT-LAMP-CRISPR/Cas12a的猪繁殖与呼吸综合征病毒2型快速诊断核酸研究解读

一、研究背景与问题

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种免疫抑制性疾病，可感染各年龄段猪只，以繁殖障碍和呼吸道症状为主要特征。PRRSV自1987年在美国首次发现以来，已成为全球养猪业经济损失最严重的病原之一。中国于1995年首次报道该病后，PRRSV-2（北美型）成为中国猪群中流行的主要基因型。2021—2023年在四川省开展的大规模分子流行病学调查显示，PRRSV-2占PRRSV阳性样本的95.65%（615/643），而PRRSV-1仅占4.35%（28/643）。尽管PRRSV-1已在中国至少28个地区被检出，但其流行率仍显著低于PRRSV-2。中国养猪业的快速扩张和高密度养殖模式的普及促进了PRRSV的传播与演化，其持续的基因多样性和抗原变异对疫病防控构成严峻挑战。

PRRSV属于网巢病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae），猪是其唯一自然宿主，主要靶向肺泡巨噬细胞。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组约15 kb，编码8种结构蛋白和至少16种非结构蛋白。其高遗传多样性、持续感染特性及空气传播、直接接触和垂直传播等多条传播途径，导致免疫应答延迟和持续病毒血症，促进了病毒播散。此外，缺乏快速便捷的诊断方法，且其临床表现与布鲁氏菌病、伪狂犬病和猪细小病毒（PPV）感染等其他猪病重叠，使得PRRSV的准确识别更加困难。在PRRSV基因组中，M基因（ORF6编码）是保守性最高的区域之一，不同毒力的北美型PRRSV分离株中M蛋白氨基酸序列同源性高达96%–100%。因此，本研究选择M基因作为靶序列，以开发快速、准确、高效的PRRSV检测技术。

现有检测方法主要包括病毒分离、抗原检测和分子生物学检测。常规逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）灵敏度和特异性较高但费时费力，且可能因病毒基因变异产生假阴性；实时荧光定量PCR（qPCR）灵敏度高且可定量，但依赖昂贵精密仪器和特异性引物，易受病毒突变影响；数字PCR（dPCR）对低丰度核酸灵敏度优异，但设备和成本高昂；环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等温扩增技术快速便捷、设备要求低，但特异性相对不足，易产生非特异性扩增和假阳性；宏基因组二代测序（mNGS）可鉴定未知病毒和新变异株，但成本高、分析复杂、耗时长。CRISPR/Cas系统凭借其附带切割活性，已发展为核酸检测平台，如Cas12a介导的DNA检测（DETECTR）和Cas13a介导的RNA检测（SHERLOCK），但通常需要等温扩增预放大以提高灵敏度。将CRISPR/Cas与等温扩增技术整合，可获得便携、高特异性、高灵敏度且操作简便的检测平台。

目前PRRSV检测主要依赖qPCR，其检测限相对较高（10¹–10² copies/μL）、处理时间较长（3–4 h）、设备昂贵。针对上述问题，本研究旨在建立一种将RT-LAMP与CRISPR/Cas12a相结合的PRRSV-2检测新方法，利用LAMP核酸扩增与Cas12a精确靶标识别的协同优势，实现更低的检测限（9.17×10^-1 copies/μL）、更短的检测时间（80–150 min）和简化操作，且结果可在蓝光、紫外光甚至自然光下用裸眼直接观察。

二、关键技术方法

研究人员首先基于PRRSV-2结构蛋白M基因保守区（GenBank登录号NC_001961.1）设计PCR引物、LAMP引物和crRNA，分别使用CRISPR-offinder、Primer5和LAMP Designer软件。从病毒阳性样本中提取RNA并逆转录为cDNA，经PCR扩增M基因片段，连接至pMD-19T载体构建重组质粒pMD19T-M。通过体外转录制备crRNA，利用PCR扩增含T7启动子的crRNA模板，以T7 RNA聚合酶转录并纯化。比较7种crRNA的Cas12a切割活性，筛选出荧光信号最强的crRNA6。随后对LAMP反应条件（温度、时间、dNTP浓度、Mg²⁺浓度）和Cas12a切割时间进行单因素优化。采用JOE和ROX两种荧光报告探针，通过蓝光、紫外光、凝胶成像系统和qPCR仪器检测荧光信号。灵敏度评价使用10倍梯度稀释的质粒标准品，比较LAMP-CRISPR/Cas12a、PCR-CRISPR/Cas12a和qPCR三种方法的检测限。特异性分析使用四种猪病毒核酸（HP-PRRSV、PEDV G2b、PRV HNJY、PPV SD-1）。临床验证使用来自河南某商业猪场同一批次56日龄表现呼吸道症状（发热、咳嗽、喘息）的50份猪血清样本，提取RNA后逆转录为cDNA，分别用RT-LAMP-CRISPR/Cas12a和qPCR检测，以qPCR为参考方法，计算阳性符合率（PPA）、阴性符合率（NPA）和总符合率（OPA）。所有实验重复三次，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，灵敏度数据用四参数logistic（4PL）非线性回归拟合。

三、研究结果

（一）筛选靶向PRRSV M基因的最优crRNA

利用qPCR仪器实时监测Cas12a介导的切割反应，在蓝光、紫外光和凝胶成像系统下比较荧光信号。在设计的7条crRNA中，crRNA6产生的荧光信号最强，亮度最高。对27株不同谱系的PRRSV-2参考毒株进行序列比对，结果显示crRNA6识别的靶区域在所有分析序列中100%保守，提示crRNA6对PRRSV-2毒株具有广泛识别潜力，因此被选用于后续实验。

（二）LAMP-CRISPR/Cas12a系统反应条件优化

以重组质粒pMD19T-M为模板，在61–69°C范围内优化LAMP扩增温度，凝胶电泳显示64°C时扩增条带最亮且特异性最好。在15–55 min范围内优化扩增时间，50 min时扩增产物最强。dNTP和Mg²⁺浓度优化结果表明，1.2 mM dNTP和4 mM Mg²⁺为最佳浓度。对Cas12a切割时间（5–30 min）进行优化，ROX和JOE两种荧光探针在Cas12a切割10 min后即可产生可检测的荧光信号。

（三）LAMP-CRISPR/Cas12a检测PRRSV M基因的灵敏度评价

采用10倍梯度稀释的质粒标准品评价分析灵敏度，比较LAMP-Cas12a、PCR-Cas12a和qPCR三种方法。结果显示，LAMP-CRISPR/Cas12a、PCR-CRISPR/Cas12a和qPCR的检测限分别为9.17×10^-1 copies/μL、9.17×10³ copies/μL和9.17×10² copies/μL。其中LAMP-CRISPR/Cas12a分析灵敏度最高，检测能力分别比PCR-CRISPR/Cas12a和qPCR高10⁴倍和10³倍。LAMP-CRISPR/Cas12a-ROX检测产生强荧光信号，信噪比良好，适合快速核酸检应用。

（四）LAMP-CRISPR/Cas12a检测PRRSV M基因的特异性评价

使用四种常见猪病毒（HP-PRRSV、PEDV G2b、PRV HNJY和PPV SD-1）评价特异性。结果显示，仅HP-PRRSV样本产生阳性荧光信号，PEDV G2b、PRV HNJY和PPV SD-1均无可检测信号，表明该检测方法在受试病原中无交叉反应。

（五）RT-LAMP-CRISPR/Cas12a检测临床PRRSV样本的应用

使用50份猪血清样本验证检测性能，以qPCR为参考方法。采用JOE和ROX荧光探针进行Cas12a切割反应，并通过qPCR仪器记录荧光强度，同时用qPCR验证同一批cDNA。50份临床血清中，qPCR检出35份阳性，阳性率为70%（35/50）。RT-LAMP-CRISPR/Cas12a与qPCR结果完全一致，总符合率为100%。35份qPCR阳性样本全部被正确识别（真阳性=35），15份阴性样本全部正确分类（真阴性=15），无假阳性和假阴性。PPA为100%（95% CI：89.7%–100%），NPA为100%（95% CI：79.4%–100%）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，PRRSV的持续变异和重组对防控构成重大挑战，亟需快速敏感的检测手段。本研究开发的RT-LAMP-CRISPR/Cas12a平台实现了简单操作条件下的快速扩增和高特异性检测，并通过荧光信号实现结果可视化。与现有方法相比，该方法的检测限（9.17×10^-1 copies/μL）低于已报道的RPA-CRISPR/Cas13a方法（172 copies/μL）和多crRNA RPA-CRISPR检测法（6 copies/μL），与文献报道的单拷贝检测能力相当。灵敏度提高可能归因于LAMP的多引物识别策略，同时Cst DNA聚合酶比RPA所需的重组酶混合物更具成本效益，适合资源有限环境的大规模应用。但LAMP反应时间较RPA长（50 min vs 30 min），且开管操作存在气溶胶污染风险。

研究局限性包括：灵敏度评价使用质粒DNA而非RNA模板，可能低估临床样本中的实际检测限；特异性评价仅涵盖四种猪病毒，需进一步针对PCV2、SIV、不同PPV亚型和PRRSV-1等共感染病原验证；该方法为PRRSV-2单靶标检测系统，无法区分混合感染，且存在因crRNA结合位点突变导致漏检的可能。临床验证仅使用来自单一猪场的50份血清，阳性率70%，100%符合率不一定适用于不同流行病学特征的人群。此外，检测仍需上游RNA提取步骤（约20 min），尚未实现真正的“样本进-结果出”一体化POCT。

结论部分：本研究建立了基于CRISPR/Cas12a与RT-LAMP扩增整合的PRRSV快速诊断平台。所开发的检测方法具有较高的分析灵敏度，且与受试猪病毒（包括PEDV G2b、PRV HNJY和PPV SD-1）无交叉反应。基于荧光的检测策略能够灵敏、快速、可视化地鉴定PRRSV-2，克服了传统诊断方法依赖专用设备和耗时长等局限性。该平台为改善PRRSV快速检测、支持猪场现场监测和防控提供了潜在的技术途径。