铅通过诱导氧化应激和激活神经炎症途径对神经元细胞具有毒性

《Brain Sciences》：Lead Is Toxic to Neuronal Cells by Inducing Oxidative Stress and Activating Neuroinflammatory Pathways

　　

背景/目的：铅（Pb）暴露是一个严重的公共卫生问题，不存在安全水平。本研究旨在探讨Pb对未分化（uSH-SY5Y）和分化（dSH-SY5Y）人神经母细胞瘤细胞的毒性，并评估亚致死铅暴露后的基因转录。方法：研究人员将Pb以0–5 mM的浓度范围应用于uSH-SY5Y和dSH-SY5Y细胞，持续4、6和24小时，并使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）和乳酸脱氢酶（LDH）检测法评估细胞活力。结果：Pb诱导了显著浓度和时间依赖性的细胞活力降低。Pb显著影响了细胞生物能量学，并以浓度和暴露时间依赖性方式减少ATP产生，触发有害活性氧（ROS）水平升高。在dSH-SY5Y细胞中，经1.25 mM Pb亚致死暴露24小时后的转录组学分析揭示了757个上调基因和2206个下调基因。通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，生物过程主要与免疫和炎症过程相关，包括细胞因子介导的信号传导。上调的差异表达基因（DEGs）包括与PI3K/Akt和细胞因子信号传导相关的基因，下调的DEGs包括与脊髓小脑性共济失调、线粒体自噬、细胞因子受体相互作用和细胞代谢相关的基因。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析确定了六个主要炎症相关的关键枢纽上调基因（CD44、CXCR4、PTGS2、IL1β、TNF、MMP9）和一个下调基因（CD4）作为Pb诱导细胞反应的潜在调节因子。疾病关联分析揭示了与化学致癌和神经退行性疾病的联系。结论：总体而言，这些发现提供了对Pb诱导神经毒性的分子机制见解，并突出了一个汇聚于神经和炎症通路的基因网络，这些基因是进一步机制研究和铅中毒后可能治疗靶点的候选对象。

铅通过诱导氧化应激和激活神经炎症途径对神经元细胞具有毒性

**论文解读**

**研究背景与问题**
铅（Pb）是一种持久性环境污染物和累积性毒物，不存在公认的安全血铅水平（BLL）。2021年全球铅暴露估计导致超过150万人死亡。人类通过摄入食物和饮用水、吸入及皮肤接触（尤其在职业环境中）暴露于铅。历史上，铅暴露主要源自采矿、冶炼、油漆、陶器和汽油等人为来源。尽管过去40年铅暴露逐步下降，但铅可在人体内生物蓄积，主要储存于骨骼和牙齿，也可储存在肝脏、骨骼肌和大脑等组织中。骨骼作为铅的储存库，半衰期达20–30年，可释放铅回血液循环，引发慢性内暴露。铅可通过诱导蛋白质和DNA损伤、表观遗传改变、线粒体功能障碍和氧化应激，损害免疫、造血、神经、心血管、肾脏和生殖系统。神经毒性作用源于Pb²⁺可替代其他二价金属阳离子如Ca²⁺，并穿越血脑屏障（BBB），在大脑中蓄积（半衰期约2–3年），诱导慢性损伤。成人神经毒性症状与BLL相关：5–10 μg/dL时可致高血压和肾功能障碍，40–79 μg/dL时认知障碍，>80 μg/dL时神经病变，100–120 μg/dL时脑病。儿童铅暴露与智商降低、注意力缺陷/多动障碍（ADHD）风险增加相关。美国疾病控制与预防中心（CDC）2021年将血铅参考值（BLRV）从5.0 μg/dL降至3.5 μg/dL。已有研究在组织、细胞亚型和单细胞水平探讨铅的神经毒性机制，但SH-SY5Y细胞模型中铅的急性浓度-毒性关系及转录组响应尚未明确，且未直接比较未分化（uSH-SY5Y）与分化（dSH-SY5Y）细胞的急性毒性阈值。分化可诱导细胞周期停滞、产生非增殖神经元、神经突分支和神经元标志物表达，可能影响对铅毒性的易感性。因此，研究人员假设SH-SY5Y细胞分化为神经元会改变其急性毒性谱，且铅会诱导应激相关的早期转录组响应。为填补这些空白，研究人员评估了uSH-SY5Y和dSH-SY5Y细胞中铅的毒性，应用转录组学分析（RNA测序）识别铅暴露诱导的差异表达基因（DEGs），并通过综合生物信息学分析绘制其相互作用网络。

**研究方法**
研究人员主要采用以下关键技术方法：
1. 细胞培养与分化：使用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系（购自欧洲认证细胞培养物保藏中心ECACC，编号ECACC-94030304），通过全反式视黄酸（RA）诱导分化获得dSH-SY5Y细胞。
2. 细胞活力检测：采用MTT法（检测细胞代谢活性）和LDH释放法（检测细胞膜损伤）评估细胞毒性，同时利用ATP生物发光法测量细胞内ATP水平以反映细胞生物能量学状态。
3. 活性氧（ROS）检测：使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）探针定量细胞内ROS水平。
4. 转录组测序与生物信息学分析：对dSH-SY5Y细胞进行1.25 mM Pb处理24小时，提取RNA进行mRNA测序（NovaSeq X Plus平台）；使用DESeq2识别DEGs（|log2FC|≥1，调整p<0.05）；通过GO和KEGG通路富集分析功能注释；利用STRING数据库构建PPI网络，MCODE插件识别功能模块，CytoHubba插件（基于MCC、度、瓶颈算法）鉴定枢纽基因；通过DisGeNET和比较毒物基因组学数据库（CTD）进行疾病关联分析。

**研究结果**

**3.1 Pb对SH-SY5Y细胞具有毒性并诱导细胞活力丧失**
通过MTT法检测，铅暴露导致uSH-SY5Y和dSH-SY5Y细胞产生浓度和时间依赖性的细胞活力下降。分化细胞对铅毒性更敏感，IC₅₀值更低（见表1）。LDH法检测也显示细胞外LDH活性显著升高，与铅浓度和暴露时间成正比，且dSH-SY5Y细胞的EC₅₀值更低，表明分化后对铅毒性更易感。此外，ATP检测显示铅暴露引起浓度和时间依赖性的细胞内ATP水平降低，dSH-SY5Y细胞更敏感，且IC₅₀值低于其他活力检测方法，提示生物能量学损伤先于细胞活力丧失。

**3.2 Pb诱导活性氧产生**
DCFDA检测显示，0.3125–5 mM Pb处理24小时导致uSH-SY5Y和dSH-SY5Y细胞中ROS产生呈浓度依赖性增加，且dSH-SY5Y细胞中ROS水平更高。

**3.3 Pb诱导dSH-SY5Y细胞转录组改变**
选择1.25 mM Pb处理dSH-SY5Y细胞24小时进行转录组测序，鉴定出2963个DEGs，其中757个上调，2206个下调。K-means聚类识别出6个基因簇，簇特异性通路富集包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用、TNF、NF-κB、AGE-RAGE、IL-17和Toll样受体信号通路。GO富集分析显示生物过程主要与免疫和炎症反应相关（如白细胞迁移、细胞因子介导的信号传导），细胞组分富集于细胞外基质、内质网腔和质膜，分子功能富集于细胞因子和趋化因子活性。KEGG通路分析显示所有DEGs富集于PI3K-AKT、NF-κB、IL-17、TNF信号和细胞因子-细胞因子受体相互作用；上调DEGs尤其富集于PI3K-AKT和细胞因子信号通路；下调DEGs富集于脊髓小脑性共济失调、线粒体自噬、细胞因子受体相互作用、细胞代谢、神经发育和稳态通路。

PPI网络分析揭示了DEGs间的密集互作，MCODE插件识别出5个功能模块（MCODE分数≥6）。CytoHubba基于三种拓扑算法（MCC、度、瓶颈）识别出7个一致性枢纽基因：6个上调基因（CD44、CXCR4、PTGS2、IL1β、TNF、MMP9）和1个下调基因（CD4），作为铅诱导细胞反应的关键调节因子。疾病关联分析显示，这些枢纽基因与阿尔茨海默病、帕金森病、脑缺血、脑梗死、卒中、神经源性炎症和神经痛等神经系统疾病显著相关。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Pb对SH-SY5Y细胞具有浓度和时间依赖性的神经毒性，且分化细胞更易感。铅诱导的ROS产生和ATP降低表明线粒体损伤和氧化应激是早期事件。转录组分析显示铅激活了免疫和炎症相关信号通路，上调的枢纽基因（如CD44、CXCR4、PTGS2、IL1β、TNF、MMP9）编码炎症介质，提示神经细胞在非免疫来源下可启动炎症样反应。下调基因主要涉及代谢和稳态功能，反映了细胞从维持代谢平衡转向免疫应激的优先级改变。这些发现与铅暴露后神经炎症、认知障碍和神经退行性疾病的关联一致。研究局限性包括使用较高浓度铅（超生理水平）以模拟急性毒性机制，但脑组织可能蓄积铅达到更高浓度；此外，转录组分析仍需进一步验证。结论部分翻译如下：

**结论**：相对高浓度的铅暴露在dSH-SY5Y细胞中诱导了显著的细胞毒性和转录组变化。铅诱导的转录组特征包括炎症相关通路的激活以及涉及细胞代谢、神经发育和稳态的蛋白质编码基因下调。这些发现表明，即使在不被认为是主要炎症驱动细胞的神经元中，铅也能通过诱导炎症样反应做出响应。因此，铅可能以牺牲代谢平衡为代价促进免疫激活，但需要在更接近生理的暴露水平下进一步验证。此外，其他细胞应激可能激活类似通路。尽管如此，识别这些过程的关键基因驱动因子为后续表征及其在铅毒性中的潜在作用提供了基础。