母体肥胖中胎盘与胎儿肝脏 TGFβ信号轴驱动胎儿免疫抑制

《iScience》：A placental and fetal liver TGFβ signaling axis drives fetal immunosuppression in maternal obesity

　　

高亮•母体肥胖诱导发育中胎儿肝脏的免疫抑制•在母体肥胖中，Spp1 促进胎盘 - 胎儿肝脏 TGFβ 串扰•TGFβ 通路和 Rbl2 上调与 T 细胞 G1 期阻滞相关摘要母体肥胖（MO）损害后代免疫发育，其机制尚不明确。通过整合饮食诱导肥胖小鼠胎盘和胎儿肝脏的单细胞 RNA 测序数据集，数据显示 MO 显著增强胎盘内的炎症和免疫激活，但在胎儿肝脏中诱导免疫抑制。器官间细胞 - 细胞通讯分析进一步揭示，由巨噬细胞发出的胎盘 Spp1 信号增强了胎儿肝脏免疫细胞中的 TGFβ/Smad 信号，促进 Rbl2 上调并诱导 T 细胞和嗜碱性粒细胞 G1 期阻滞。最后，T 细胞功能被 MO 抑制。总之，本研究鉴定了一条与 MO 引起的胎儿免疫抑制相关的潜在胎盘 - 胎儿肝脏 Spp1-TGFβ-Rbl2 轴。图形摘要引言当前美国国家卫生统计中心（NCHS）的流行病学数据显示，美国孕前肥胖呈现显著上升趋势，患病率从 2016 年到 2022 年从 26.1% 上升到 31.6%。这一变化日益被认为是不良后代发育的主要驱动力，范围从新生儿免疫失调到成年发病的代谢综合征。高母体体重指数（BMI）与新生儿脓毒症风险增加密切相关，这主要是由免疫反应不成熟引起的，暗示母体肥胖（MO）损害胎儿免疫系统发育。母体对后代免疫系统的“教育”是通过胎盘或母乳垂直转移母体抗体、微生物群及其代谢物、免疫细胞和细胞因子来实现的，从而在塑造后代免疫系统中发挥长期作用，这意味着胎儿免疫系统的发育轨迹与母体炎症环境密切相关。值得注意的是，MO 通过引发妊娠期间的代谢失调诱导慢性低度炎症（代谢炎症）。这种全身炎症状态产生大量促炎细胞因子，可能损害免疫耐受，改变胎盘免疫细胞功能，并破坏母胎界面的营养和氧气供应。因此，这种受扰环境使胎儿暴露于升高的炎症信号中，可能重新编程其免疫系统发育。巨噬细胞作为母胎界面的主要免疫哨兵，具有独特的功能可塑性，使其能够协调炎症与母胎免疫耐受之间的微妙平衡。虽然 MO 诱导的代谢炎症通常驱动胎盘巨噬细胞向促炎表型发展并破坏局部微环境，但关于这种母体炎症状态如何转化为胎儿免疫景观仍存在复杂的逻辑悖论。小鼠的新兴证据表明，作为对母体炎症刺激（如急性脂多糖（LPS）挑战）的反应，胎儿免疫系统并非简单地发起反射性炎症反应。相反，它采取抑制的功能状态以保护胎儿免受过度免疫病理损害。与此一致，在肥胖母亲出生的新生儿脐带血（UCB）中也观察到了免疫抑制。这种表型的特点是单核细胞中促炎细胞因子水平降低，以及在体外刺激试验中对大肠杆菌的反应减弱。值得注意的是，MO 诱导的代谢炎症创造了一个以持续暴露于促炎细胞因子为特征的慢性恶劣环境。这种类似于免疫耐受状态的补偿性抑制，旨在保护发育中的胎儿免受慢性母体炎症损伤造成的附带损害。因此，虽然母胎界面以炎症为特征，但产生的胎儿表型通常表现为功能抑制状态，这由新生儿对急性挑战的反应受损所证明。因此，这表明胎儿免疫抑制并非被动缺陷，而是对持续母体炎症压力的病理性适应。然而，这种母体炎症通过胎盘调节胎儿免疫功能的确切机制仍知之甚少。巨噬细胞的调节潜力内在与其异质性亚群相关。虽然经典 M1 巨噬细胞通过分泌 IL-1、IL-6 和 TNFα 传播炎症信号，但 M2 样亚群通过释放 IL-10 和转化生长因子β（TGFβ）促进免疫稳态。作为免疫抑制的主调节因子，TGFβ 促进调节性 T 细胞（Tregs）的分化，并通过阻滞其细胞周期来抑制效应 T 细胞的激活和增殖。值得注意的是，最近鉴定出的 Spp1+ 巨噬细胞亚群已显示出在肿瘤中具有强大的免疫抑制和免疫逃逸能力。这些细胞高表达 Spp1，这是一种免疫反应的关键介质，在癌症和炎症性疾病等病理条件下经常与不良结果相关。有趣的是，Spp1 不仅减弱 T 细胞细胞毒性，还协同增强 TGFβ 信号的激活。鉴于 Spp1+ 巨噬细胞是胎盘的组成亚群，这种特定亚群在 MO 诱导的环境中很可能充当免疫刹车。通过将母体炎症压力整合为局部免疫抑制信号，这些细胞可能从根本上重塑胎儿免疫系统的发育轨迹。迄今为止，胎盘巨噬细胞在介导 MO 诱导的炎症对胎儿免疫系统影响中的具体作用仍知之甚少。在此，通过利用整合的小鼠胎盘和胎儿肝脏组织的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析，我们确定 MO 通过胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞之间运作的特定 Spp1-TGFβ-Rbl2 信号轴驱动胎儿免疫抑制。结果 MO 增强胎盘中的炎症和免疫反应为了阐明 MO 对胎盘炎症和免疫的影响，我们分析了 E17.5 小鼠胎盘的 scRNA-seq 数据集。主要免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、T 细胞、嗜碱性粒细胞和 B 细胞，根据特定标志物被分离（图 1A）（表 S1；图 S1A）。巨噬细胞被进一步分类为胎盘相关母体巨噬细胞（PAMMs）和胎儿霍夫鲍尔细胞（HBCs）。具体而言，使用 Y 连锁基因（Uty、Kdm5d、Ddx3y 和 Eif2s3y）鉴定雄性胎儿巨噬细胞，然后训练随机森林分类器以区分母体和雌性胎儿细胞（图 S2）。与 CT 组相比，MO 组中 PAMMs 和中性粒细胞细胞的比例下降，但其他免疫细胞增加（图 1B）。差异表达基因（DEGs）分析显示，与 CT 组相比，MO 组中有 193 个显著下调和 118 个显著上调基因（图 1C）；MO 组上调基因的基因本体论（GO）术语富集分析显示与炎症和免疫相关的生物过程强相关（图 1D），这暗示 MO 上调了胎盘中的免疫和炎症反应。此外，涉及免疫（C1qa）和炎症（Il1b、Cxcl2、Ccl3 和 Ccl4）过程的基因主要在巨噬细胞中表达（图 1E），且 MO 显著增加了这些基因在巨噬细胞中的表达水平（图 1F），暗示 MO 诱导巨噬细胞炎症反应。为了确定在 PAMMs 或 HBCs 中是否发生炎症（M1）极化，我们对这两种群体进行了极化分析，发现 MO 组中 PAMMs 和 HBCs 的 M1 极化细胞比例均升高（图 S3）。这些发现表明，MO 驱动胎盘巨噬细胞（PAMMs 和 HBCs）向促炎表型发展。图 1 小鼠胎盘 scRNA-seq 景观概述显示完整标题图查看器（A）小鼠胎盘中识别出的细胞类型的 UMAP 可视化。（B）MO 组和 CT 组之间细胞类型比例的比较。（C）展示 MO 组和 CT 组之间 DEGs 的火山图。（D）显示 MO 组上调基因 GO 术语富集分析的气泡图。（E）显示涉及免疫和炎症相关过程的基因表达模式的 UMAP 特征图。（F）相应的提琴图量化 CT 和 MO 组胎盘巨噬细胞中（E）这些基因的差异表达。差异表达分析使用威尔科克森秩和检验（???调整 p < 0.001）。MO 在胎儿肝脏中诱导免疫抑制肝脏是晚期小鼠胚胎产生免疫细胞的主要器官。为了调查 MO 对 E17.5 胎儿肝脏胎儿免疫和炎症反应的影响，我们使用特定标志物进行了细胞类型注释（表 S1；图 S1B），并识别出的主要免疫细胞是中性粒细胞、B 细胞和巨噬细胞（图 2A）。与 CT 组相比，MO 组中巨噬细胞和中性粒细胞的比例增加，但 B 细胞减少（图 2B）。DEGs 分析表明，与 CT 组相比，MO 组中有 55 个下调和 353 个上调基因（图 2C），且 MO 组下调基因的 GO 术语富集分析与免疫相关的生物过程强相关（图 2D），暗示 MO 下调了胎儿肝脏中的免疫反应。这些与免疫反应过程相关的下调基因主要在中性粒细胞、B 细胞和巨噬细胞中表达（图 2E），且在 MO 条件下胎儿肝脏免疫细胞中它们的表达水平显著降低（图 2F）。此外，基因集富集分析（GSEA）揭示 MO 抑制了几个免疫相关的生物过程，“B 细胞介导的免疫”，“先天免疫反应”，“免疫反应的积极调节”和“免疫反应的激活”（图 2G），表明 MO 在胎儿中诱导免疫抑制。此外，为了确定 MO 对胎儿肝脏免疫的影响是否具有性别特异性，我们首先基于 Y 连锁基因和 X 连锁基因 Xist 的表达将免疫细胞分类为雄性和雌性组（图 S4）。在进行性别分化的 DEGs 和 GO 分析后，我们的结果表明 MO 对雌性胎儿免疫系统施加更强的抑制作用。这种性别二态性突出体现在 MO 组中下调的基因仅在雌性中显著富集于免疫相关的 GO 术语，而雄性中不存在这一趋势（图 S5）。图 2 小鼠胎儿肝脏 scRNA-seq 景观概述显示完整标题图查看器（A）小鼠胎儿肝脏中识别出的细胞类型的 UMAP 可视化。（B）MO 组和 CT 组之间细胞类型比例的比较。（C）展示 MO 组和 CT 组之间 DEGs 的火山图（排除红细胞）。（D）显示 MO 组下调基因 GO 术语富集分析的气泡图（排除红细胞）。（E）显示涉及免疫相关过程的基因表达模式的 UMAP 特征图。（F）相应的提琴图量化 CT 和 MO 组胎儿肝脏免疫细胞中（E）这些基因的差异表达。差异表达分析使用威尔科克森秩和检验（???调整 p < 0.001）。（G）GSEA 图说明与 CT 组相比，MO 组胎儿肝脏免疫细胞中受抑制的免疫相关生物过程。MO 增强胎盘和胎儿肝脏细胞间 TGFβ 介导的通讯为了阐明在 MO 下胎盘如何协调胎儿免疫发育，我们整合了来自胎盘和胎儿肝脏的 scRNA-seq 数据集（图 S6），并使用 CellChat 进行跨器官细胞 - 细胞通讯分析。虽然 MO 组中相互作用的总数（图 3A 和 3C）增加，但与 CT 组相比，相互作用的整体相互作用强度（图 3B 和 3D）减弱。比较 MO 组和 CT 组之间的整体信息流，IL1 和 TGFβ 信号通路在 MO 组中表现出显著更高的相对信息流强度（图 3E）。模式识别分析揭示 IL1 信号主要源自胎盘 HBCs 并靶向胎儿肝脏 T 细胞。此外，TGFβ 信号主要由胎盘巨噬细胞（HBCs、PAMMs 和 Mφ）分泌，MO 组中增强的外发信号靶向胎儿肝脏免疫细胞（图 3F–3I）。这些发现表明，MO 驱动从胎盘巨噬细胞到胎儿肝脏免疫细胞的炎症和 TGFβ 信号增加， specifically 靶向 T 细胞群体。图 3 小鼠胎盘和胎儿肝脏细胞间通讯概述显示完整标题图查看器（A）说明相互作用差异数量的圆形图。红色边缘表示与 CT 数据集相比，MO 数据集中增加的信号相互作用。（B）说明相互作用强度差异的圆形图。红色边缘表示与 CT 组相比，MO 组中增加的相互作用数量和强度，而蓝色边缘表示减少的相互作用。

边的宽度对应于差异的幅度。(C) 比较两组之间相互作用总数的柱状图。(D) 比较两组之间总相互作用强度的柱状图。(E) 比较两组之间信号通路相对信息流的堆叠柱状图。(F–I) CT 组和 MO 组中发出和接收的通讯模式，说明了各种胎盘和胎儿肝脏细胞群体作为分泌者的信号作用。MO 条件下胎盘巨噬细胞来源的 Spp1 信号增强了胎儿肝脏免疫细胞中的 TGFβ信号

先前的研究表明，巨噬细胞通过分泌 IL-10 和 TGFβ等抑制性因子来介导炎症相关的免疫抑制。鉴于胎盘巨噬细胞被确定为对炎症的主要反应者，我们假设它们有助于胎儿肝脏的免疫抑制。先前的研究报告称 Spp1 可以增强 TGFβ信号的激活。为了探索这一点，我们分析了胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏免疫细胞之间的 Spp1 信号通讯。具体而言，我们将胎盘巨噬细胞亚群（PAMMs、HBCs 和 Mφ：这些亚群来源于胎儿肝脏单核细胞，这些细胞定植于胎盘，随后与胎儿肝脏巨噬细胞共享保守的转录组特征）定义为信号发送者，将胎儿肝脏免疫细胞（B 细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和 T 细胞）定义为信号接收者。我们发现，在 CT 组中，Spp1 信号通讯主要由 Spp1-Cd44 和 Spp1-(Itga4+Itgb1) 配体 - 受体对介导（图 4A）；除了这些基线相互作用外，我们观察到 MO 组中出现了 Spp1-(Itgav+Itgb3) 和 Spp1-(Itgav+Itgb1) 对（图 4B）。在两组中，Spp1-Cd44 和 Spp1-(Itga4+Itgb1) 仍然是具有最高通讯概率的主导相互作用。值得注意的是，胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞之间观察到了最高的整体通讯概率（图 4A 和 4B）。对整合数据集中基因表达谱的分析证实，Spp1 主要在胎盘来源的 PAMMs、HBCs 和 Mφ中表达，与 CT 组相比，MO 组的表达水平更高（图 4C 和 4D）。此外，我们观察到 MO 条件下胎儿肝脏 T 细胞中受体 Itga4 和 Itgav 的表达上调，以及胎儿肝脏中性粒细胞和巨噬细胞中 Cd44 表达的增加（图 4C 和 4D）。我们进一步探索了驱动这些相互作用的特定配体 - 受体对，发现 MO 特异性地增强了朝向胎儿肝脏巨噬细胞和中性粒细胞的 Spp1-Cd44 信号（图 4E 和 4F）。同时，MO 诱导的整合素介导相互作用（Spp1-Itga4+Itgb1, Spp1-Itgav+Itgb3, 和 Spp1-Itgav+Itgb1）的增强主要指向胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞（图 4G–4J）。总的来说，这些结果表明 MO 增强了胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏免疫细胞之间由 Spp1 介导的串扰，并明显倾向于靶向 T 细胞和嗜碱性粒细胞。

图 4 小鼠胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏免疫细胞之间的 Spp1 信号通讯
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(A 和 B) 气泡图说明了 CT (A) 和 MO (B) 组中胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏免疫细胞之间 Spp1 信号的通讯概率。图表显示了配体 - 受体对相互作用，其中胎盘巨噬细胞被定义为信号源（发送者），胎儿肝脏免疫细胞被定义为目标（接收者）。
(C 和 D) 气泡图显示了 CT (C) 和 MO (D) 组中涉及 Spp1 信号通路的所有基因在不同细胞群体中的表达谱。
(E–J) 通讯网络图显示了 CT (E 和 H) 和 MO (F, G, I 和 J) 组中胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏免疫细胞之间 Spp1 通路内的特定配体 - 受体对。

我们接下来研究了胎盘巨噬细胞（发送者）与胎儿肝脏免疫细胞（接收者）之间的 TGFβ信号串扰。这种相互作用主要由 Tgfb1-(Tgfbr1+Tgfbr2) 配体 - 受体对介导，通讯信号主要定向从胎盘巨噬细胞到胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞（图 5A 和 5B）。对整合数据集中 TGFβ信号通路的基因表达谱分析显示，配体 Tgfb1 在胎盘亚群（PAMMs、HBCs 和 Mφ）以及胎儿肝脏 B 细胞、嗜碱性粒细胞和内皮细胞中高度表达。值得注意的是，与 CT 组相比，MO 组中 Tgfb1 的表达水平升高。关于受体表达，MO 上调了胎儿肝脏嗜碱性粒细胞中的 Acvr1b 水平和 T 细胞中的 Tgfbr2 水平（图 5C 和 5D）。对特定 Tgfb1-(Tgfbr1+Tgfbr2) 相互作用的分析表明，MO 组中朝向胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞的通讯强度增强（图 5E 和 5F）。此外，我们检查了胎儿肝脏内的组织内 TGFβ信号。我们发现，MO 组中源自胎儿肝脏巨噬细胞并靶向其他免疫细胞的 TGFβ信号增强了。此外，来自各种胎儿肝脏免疫亚群的 TGFβ信号主要汇聚于 T 细胞，这种流入在 MO 条件下进一步放大。

图 5 小鼠胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏免疫细胞之间的 TGFβ信号通讯
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(A 和 B) 气泡图说明了 CT (A) 和 MO (B) 组中胎盘巨噬细胞与胎儿肝脏免疫细胞之间 TGFβ信号的通讯概率。图表显示了配体 - 受体对相互作用，其中胎盘巨噬细胞被定义为信号源（发送者），胎儿肝脏免疫细胞被定义为目标（接收者）。
(C 和 D) 气泡图显示了 CT (C) 和 MO (D) 组中涉及 TGFβ信号通路的所有基因在不同细胞群体中的表达谱。
(E–H) 通讯网络图显示了 CT (E 和 G) 和 MO (F 和 H) 组中 TGF-β通路内的特定配体 - 受体对。(E) 和 (F) 显示了胎盘巨噬细胞作为信号发送者，胎儿肝脏免疫细胞作为接收者的相互作用。(G) 和 (H) 显示了胎儿肝脏免疫细胞同时作为信号发送者和接收者的相互作用。

总的来说，这些结果表明胎盘巨噬细胞来源的 TGFβ信号主要靶向胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞，并且这一轴被 MO 显著增强。总体而言，我们的数据表明胎盘巨噬细胞来源的 Spp1 信号与胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞的 TGFβ活性协同作用。

MO 促进 TGFβ/Smad 信号的激活并损害胎儿免疫细胞的细胞周期进程
TGFβ信号级联由其配体、受体和下游 Smad 效应器协同介导。我们检查了胎儿肝脏免疫群体中经典 TGFβ通路组分的表达。Tgfb1 是胎儿肝脏免疫区室中主要表达的配体。虽然其在 MO 和 CT 组之间的表达水平相当，但其受体（Tgfbr1, Tgfbr2 和 Tgfbr3）和下游效应器（Smad2, Smad3 和 Smad4）的表达在 MO 组中显著上调，特别是在 T 细胞和嗜碱性粒细胞中（图 6A）。这些结果为 MO 增强了胎儿肝脏免疫细胞内的 TGFβ信号活性提供了有力证据。后续对功能基因标志物的分析显示，MO 特异性地下调了与 T 细胞功能相关的基因，如 Gzmb 和 Cd3g。相比之下，其他免疫群体的功能谱基本保持不变，嗜碱性粒细胞除外，后者表现出 Cpa3 和 Hdc 的上调（图 6B）。这些发现意味着 TGFβ信号的激活主要损害 T 细胞功能。对增殖相关基因的检查显示，MO 导致 T 细胞和嗜碱性粒细胞中增殖标志物 Pcna 和 Mki67 的下调，同时上调了细胞周期抑制因子 Rbl2（图 6A）。这表明观察到的 T 细胞功能抑制可能在机制上与细胞周期停滞有关。为了测试这一点，我们对胎儿肝脏免疫细胞进行了细胞周期分布分析，结果显示 MO 组中 T 细胞和嗜碱性粒细胞在 G1 期的比例显著增加（图 6C 和 6D），表明升高的 TGFβ信号可能在这些群体中诱导 G1 细胞周期停滞。

图 6 小鼠胎儿肝脏免疫细胞中 TGFβ信号与细胞周期的关系
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(A) 小提琴图显示了胎儿肝脏免疫细胞中与 TGFβ/Smad 信号通路和细胞周期相关的基因的表达水平。
(B) 小提琴图显示了胎儿肝脏免疫细胞中与免疫功能相关的基因的表达水平。
(C 和 D) CT (C) 和 MO (D) 组中每种胎儿肝脏免疫细胞类型内的细胞周期阶段分布。
(E–I) 胎儿肝脏 T 细胞在 G1 期特异性表达的 TGFβ/Smad 信号通路和细胞周期相关基因的表达水平。
(J–N) 胎儿肝脏嗜碱性粒细胞在 G1 期特异性表达的 TGFβ/Smad 信号通路和细胞周期相关基因的表达水平。

为了确认这一机制，我们特异性分析了胎儿肝脏中 T 细胞和嗜碱性粒细胞 G1 期群体内的基因表达。我们发现 TGFβ信号通路组分在 MO 组 G1 期持续上调（图 6E–6H 和 6J–6M）。此外，MO 条件下 G1 期细胞中细胞周期抑制因子 Rbl2 的水平升高（图 6I 和 6N）。总的来说，这些结果表明 MO 通过上调 TGFβ信号和 Rbl2 表达，促进胎儿肝脏 T 细胞和嗜碱性粒细胞的 G1 停滞，最终导致胎儿免疫抑制。

为了进一步验证这些发现，我们定量了 E17.5 胎盘中的 Spp1 蛋白水平，以及 E17.5 胎儿肝脏中的 TGFβ1 和 Rbl2。结果显示，MO 显著上调了胎盘 Spp1（图 7A 和 7B），并同时增加了胎儿肝脏中 Rbl2 和 TGFβ1 的表达（图 7C–7E）。这些数据强化了以下假设：升高的胎盘 Spp1 可能刺激胎盘巨噬细胞产生更高水平的 TGFβ1。进而，这作用于胎儿肝脏免疫细胞，通过 Rbl2 上调抑制其细胞周期，最终诱导胎儿免疫抑制。

图 7 胎盘 Spp1 和胎儿肝脏 TGFβ1/Rbl2 轴的验证
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(A 和 B) E17.5 胎盘中 SPP1 的代表性蛋白印迹条带和相对定量。
(C–E) E17.5 胎儿肝脏中 Rbl2 和 TGFβ1 的代表性蛋白印迹条带和相对定量。数据以均值 ± SEM (n ≥ 4) 表示。?p < 0.05 采用 Mann-Whitney U 检验。

讨论
MO 导致了一种慢性炎症环境，其特征是促炎细胞因子的系统性升高，这可以穿过胎盘屏障传递，从而塑造胎儿免疫系统的发育轨迹。在本研究中，我们发现 MO 显著增加了晚孕小鼠胎盘内的炎症水平。值得注意的是，这伴随着胎儿肝脏免疫功能的同步抑制。这表明 MO 诱导的炎症可能通过胎盘抑制胎儿免疫功能。有趣的是，我们的发现与一项先前的研究一致，该研究表明晚孕小鼠中由 LPS 诱导的母体炎症会触发胎儿紧急骨髓生成的抑制。此外，我们的结果也与一项先前的研究一致，该研究表明 MO 损害新生儿免疫细胞功能，从而降低其抗菌能力。这种抑制性免疫反应可能作为一种稳态适应，以限制过度炎症并保护胎儿存活。胎盘充当关键的调节守门人，抗炎细胞因子 IL-10 通过抑制母体炎症刺激来保护胎儿。总的来说，这些强调了母体微环境的变化可以通过胎盘介导来校准胎儿免疫发育。

巨噬细胞充当炎症的中央调节器，协调炎症反应的启动、维持和解决。此外，它们充当先天免疫和适应性免疫之间的关键桥梁，在炎症和免疫功能之间的串扰中发挥关键作用。在本研究中，我们发现 MO 上调了胎盘炎症相关过程，炎症特征主要在巨噬细胞中富集。值得注意的是，MO 上调了胎盘巨噬细胞中 Spp1 的表达，已知 Spp1+ 巨噬细胞能抑制免疫并促进对免疫治疗的抵抗，这可以通过 SPP1-CD44 轴驱动 CD8+ T 细胞耗竭从而在人类中诱导免疫抑制。在我们的研究中，MO 背景下的胎盘巨噬细胞来源的 Spp1 特异性地增强了与胎儿肝脏 T 细胞上整合素受体（Itga4 和 Itgb1）的相互作用。此外，这种相互作用伴随着胎盘 Spp1+ 巨噬细胞与胎儿肝脏 T 细胞之间 TGFβ信号的增强。这表明 Spp1 可以协同 TGFβ活性，与先前表明 Spp1 增强 TGFβ信号激活的研究一致。最终，胎盘 Spp1+ 巨噬细胞可能通过 Spp1 和 TGFβ信号的协同效应抑制胎儿肝脏 T 细胞功能。

TGFβ对先天免疫和适应性免疫的抑制作用已有充分文献记录。与此一致，我们观察到 MO 上调 TGFβ信号与 T 细胞功能基因（如 Gzmb 和 Cd3g）的下调同时发生。

此外，MO 诱导的 TGFβ信号通路上调伴随着细胞周期抑制因子 Rbl2 表达的增加以及 T 细胞中 G1 期比例的提高，这与 TGFβ通过诱导细胞周期停滞 exert 免疫抑制从而抑制 T 细胞增殖的机制一致。此外，我们的蛋白质印迹结果揭示，MO 同时上调了胎盘中 Spp1 的蛋白水平，以及胎儿肝脏中的 TGFβ1 和 Rbl2。综上所述，这些数据表明，在 MO 条件下胎儿肝脏中 T 细胞功能的抑制可能是通过 Spp1-TGFβ-Rbl2 轴驱动的。MO 诱导的胎儿 T 细胞功能抑制具有重要的临床意义。鉴于胎儿期是免疫系统“教育”的关键窗口期，生命早期的 T 细胞损伤可能触发持续的免疫重塑。这种缺陷可能增加新生儿期对感染的易感性。此外，T 细胞稳态的破坏以及免疫耐受发育的潜在扰动可能增加晚年患自身免疫性疾病的风险，如 1 型糖尿病和系统性红斑狼疮。这些强调了 MO 的影响超出了代谢编程，从根本上塑造了后代一生的免疫景观。

总之，MO 诱导胎盘巨噬细胞发生炎症反应，这与胎儿肝脏中的免疫抑制相关。具体而言，上调的炎症水平促进了胎盘巨噬细胞 Spp1 信号，这进一步增强了胎儿免疫细胞，尤其是 T 细胞和嗜碱性粒细胞中的 TGFβ信号，伴随着 Rbl2 上调和 G1 期停滞，导致胎儿肝脏免疫抑制。

研究的局限性

应注意本研究的几个局限性。首先，尽管我们的研究证明了胎盘 Spp1 和胎儿肝脏 TGFβ1 及 Rbl2 轴的持续上调，但目前的发现，特别是关于器官间信号传递的发现，主要是通过 CellChat 等生物信息学工具和相关性证据推断出来的。需要进一步的干预研究，如体外共培养模型或体内 Spp1 中和，以确切建立因果关系并阐明精确的生理机制。其次，由于 TGFβ广泛表达，我们的研究专门关注了选定的胎盘巨噬细胞群和胎儿肝脏免疫细胞之间的串扰；未来的研究应探讨涉及其他胎盘细胞类型的潜在相互作用。最后，虽然 MO 将上调的 TGFβ信号与胎儿肝脏免疫细胞周期停滞联系起来，但确切的下游分子级联反应仍有待完全阐明，以指导未来的靶向免疫疗法。

资源可用性

主要联系人

有关更多信息和资源的请求应联系主要联系人 Min Du ([e-mail])，并将由其履行。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性

•Batorsky 等人提供的 E17.5 小鼠胎盘单细胞 RNA 测序数据在 GEO: GSE252343 上公开可用。Kou 等人提供的 E17.5 小鼠胚胎肝脏单细胞 RNA 测序数据在 GEO: GSE303768 上公开可用。
•所有原始代码已存入 Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.21796860，可免费公开获取。源代码也可在 GitHub 上获取：https://github.com/kzy122/E17.5-placenta-liver-scRNAseq。
•重新分析本论文报告数据所需的任何附加信息，可应要求从主要联系人处获取。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院资助项目 R01HD067449 支持。

作者贡献

概念化，Z.K. 和 M.D.；方法论，Z.K.、L.-W.C.、S.I. 和 M.D.；调查，Z.K.、L.-W.C.、S.I.、M.N.H.、X.L.、C.S. 和 Q.C.；撰写 - 原稿，Z.K.；撰写 - 审查和编辑，Z.K.、J.M.d.A.、M.-J.Z. 和 M.D.；资金获取，M.D.；资源，J.M.d.A.、M.-J.Z. 和 M.D.；监督，M.D.。

利益声明

所有作者声明没有竞争利益。

STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| :--- | :--- | :--- |
| **抗体** | | |
| 骨桥蛋白/SPP1 (E9Z1D) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 货号# 88742; RRID: AB_3107209 |
| RBL2 (D9T7M) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 货号# 13610; RRID: AB_2798274 |
| TGF beta 1 多克隆抗体 | Bioss | 货号# bs-0086R; RRID: AB_10856457 |
| 小鼠抗 beta-微管蛋白单克隆抗体 (克隆 E7) | 发育研究杂交瘤银行 (DSHB) | 货号# E7; RRID: AB_528499 |
| IRDye 800CW 驴抗兔 IgG 二抗 | LI-COR Biosciences | 货号# 925–32213; RRID: AB_2715510 |
| IRDye 680RD 羊抗鼠 IgG 二抗 | LI-COR Biosciences | 货号# 925–68180; RRID: AB_2814918 |
| **生物样本** | | |
| E17.5 小鼠胎盘 | 瘦型和肥胖型母鼠 | 不适用 |
| E17.5 小鼠胚胎肝脏 | 瘦型和肥胖型母鼠 | 不适用 |
| **化学品、肽类和重组蛋白** | | |
| 含 10 kcal% 脂肪的普通饲料 | Research Diets Inc. | 货号# D12450J |
| 含 45 kcal% 脂肪的高脂饲料 | Research Diets Inc. | 货号# D12451 |
| 含 60 kcal% 脂肪的高脂饲料 | Research Diets Inc. | 货号# D12492 |
| **存入数据** | | |
| E17.5 小鼠胎盘单细胞 RNA 测序 | Batorsky 等人 | GEO: GSE252343 |
| E17.5 小鼠胚胎肝脏单细胞 RNA 测序 | Kou 等人 | GEO: GSE303768 |
| **实验模型：生物体/品系** | | |
| 小鼠：C57BL/6J | 杰克逊实验室 | JAX:000664, RRID: IMSR_JAX:000664 |
| **软件和算法** | | |
| Prism 9.5.1 | GraphPad | https://www.graphpad.com/updates/prism-951-release-notes |
| R 4.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/ |
| cellranger 8.0.1 | 10x Genomics | https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/8.0 |
| Seurat 5.0.2 | Hao 等人 | https://satijalab.org/seurat/ |
| SeuratObject 5.0.1 | Satija 等人 | https://github.com/satijalab/seurat-object/releases?page=1 |
| tidyverse 2.0.0 | Wickham 等人 | https://cran.r-project.org/web/packages/tidyverse/index.html |
| dplyr 1.2.0 | Wickham 等人 | https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html |
| patchwork 1.3.2 | Pedersen | https://cran.r-project.org/web/packages/patchwork/index.html |
| ggplot2 4.0.2 | Wickham | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html |
| ggpubr 0.6.3 | Kassambara | https://cran.r-project.org/web/packages/ggpubr/index.html |
| ggthemes 5.1.0 | Arnold | https://cran.r-project.org/web/packages/ggthemes/index.html |
| clusterProfiler 4.18.4 | Wu 等人 | https://guangchuangyu.github.io/software/clusterProfiler/ |
| enrichplot 1.30.5 | Yu | https://master.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/enrichplot.html |
| org.Mm.eg.db 3.22.0 | Carlson | https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Mm.eg.db.html |
| CellChat 2.1.2 | Jin 等人 | https://github.com/jinworks/CellChat |
| ggridges 0.5.7 | Wilke | https://cran.r-project.org/web/packages/ggridges/index.html |
| ggsci 4.2.0 | Xiao | https://cran.r-project.org/web/packages/ggsci/index.html |
| tidyr 1.3.2 | Wickham 等人 | https://cran.r-project.org/web/packages/tidyr/index.html |
| gprofiler2 0.2.4 | Kolberg 等人 | https://cran.r-project.org/web/packages/gprofiler2/index.html |
| macSpectrum 0.1.0 | Li 等人 | https://macspectrum.uconn.edu/ |
| ggrepel 0.9.8 | Slowikowski | https://cran.r-project.org/web/packages/ggrepel/index.html |
| pROC 1.19.0.1 | Robin 等人 | https://cran.r-project.org/web/packages/pROC/index.html |
| caret 7.0.1 | Kuhn | https://cran.r-project.org/web/packages/caret/index.html |
| RColorBrewer 1.1.3 | Neuwirth | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/index.html |
| NMF 0.28 | Gaujoux & Seoighe | https://cran.r-project.org/web/packages/NMF/index.html |
| ggalluvial 0.12.6 | Brunson | https://cran.r-project.org/web/packages/ggalluvial/index.html |
| ranger 0.18.0 | Wright & Ziegler | https://cran.r-project.org/web/packages/ranger/index.html |
| 用于 scRNA-seq 分析的定制 R 脚本 | 本论文 | GitHub: https://github.com/kzy122/E17.5-placenta-liver-scRNAseq; Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.21796860 |

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实验模型和研究参与者详情

小鼠

所有动物操作均经华盛顿州立大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准 (方案编号 6704)。总共 12 只五周龄雌性 C57BL/6 小鼠被随机分配到两个饮食组 (每组 n = 6)：对照组 (CT)，喂食含 10 kcal% 脂肪的标准普通饲料 (D12450J, Research Diets Inc.)，以及母体肥胖组 (MO)，喂食含 60 kcal% 脂肪的高脂饲料 (D12492, Research Diets Inc.)。小鼠维持在温控和湿控设施中，12 小时光照/12 小时黑暗循环，自由进食和饮水。喂食 8 周后，CT 和 MO 组之间体重差异超过 20%，将雌性与成年 C57BL/6 雄鼠配对。出现阴道栓被指定为胚胎第 0.5 天 (E0.5)。确认怀孕后，MO 母鼠转换为含 45 kcal% 脂肪的高脂饲料 (D12451, Research Diets Inc.)，而 CT 母鼠继续喂食标准普通饲料。在 E17.5 时，孕鼠用 CO2 麻醉并通过颈椎脱臼处死。立即收获雄性和雌性胚胎的胎儿肝脏和胎盘，并在液氮中速冻直至后续分析。

方法详情

单细胞 RNA 测序数据处理和分析

E17.5 胎儿肝脏的 scRNA-seq 数据 (对照：CT, n = 9; MO, n = 9) 从 GEO 数据库获取，登录号 GSE303768，E17.5 胎盘数据 (CT, n = 9; MO, n = 8) 从登录号 GSE252343 检索。具体而言，每个 GEO 数据集包括来自两个治疗组的样本：怀孕前喂食标准普通饲料的小鼠和喂食高脂饲料 (60% kcal 来自脂肪) 的小鼠。对于数据分析，我们遵循标准的 10x 工作流程来处理和 分析 scRNA-seq 数据。混合样本使用 CellRanger (v8.0) 进行解复用，以比对参考基因组 mm10 生成唯一分子标识符 (UMI) 计数矩阵，随后使用 Seurat (v5.2.1) 进行分析。为了确保高数据质量，我们排除了在少于 3 个细胞中检测到的基因，并过滤掉检测到特征少于 300 个或线粒体转录本含量超过 20% 的低质量细胞。过滤后的数据进行归一化和缩放，随后识别高变异基因。然后我们通过主成分分析 (PCA) 进行降维，并使用统一流形近似和投影 (UMAP) 可视化结果。不同的细胞簇通过无监督聚类识别，最后基于建立标记基因的表达进行注释。

CT 和 MO 组之间的差异表达基因 (DEGs) 使用 Seurat 中的 FindMarkers 函数识别，采用簇内、细胞水平比较框架。具体而言，我们使用 Wilcoxon 秩和检验比较组间细胞。为了确保生物学相关性和统计严谨性，我们应用了 10% 细胞的最小表达阈值 (min.pct = 0.1) 和 0.5 的最小自然对数倍数变化阈值 (logfc ≥0.5)。所有 p 值使用 Bonferroni 校正进行多重测试调整，调整后的 p 值 <0.05 的基因被认为显著差异表达。生成的 DEGs 随后进行基因本体 (GO) 术语富集分析和基因集富集分析 (GSEA) 以识别受扰动的生物过程。这些功能分析使用 R (v4.5.1) 中的 clusterProfiler 包 (v4.12.6) 进行。对于 GSEA，基因按其倍数变化值排序，显著性使用置换检验确定，调整后 p 值 cutoff 为 0.05。

基于机器学习的母体和胎儿巨噬细胞鉴定

在人类胎盘中，母体巨噬细胞和胎儿巨噬细胞可以通过既定的特异性标记物区分。然而，小鼠胎盘缺乏此类明确的标记物；因此，大多数小鼠研究依赖人类衍生的标记物，这可能会影响准确性。为了解决这个问题，我们将生物学验证与机器学习相结合。在使用泛标记物识别总胎盘巨噬细胞后，我们利用雄性胎盘中 Y 染色体基因表达明确分离母体和胎儿细胞。然后使用这个遗传验证的数据集训练随机森林分类器，我们将其应用于雌性胎盘以准确识别母体和胎儿巨噬细胞群。

胎盘巨噬细胞极化评估

从 Seurat 对象中提取母体和胎儿巨噬细胞亚集，并使用 macSpectrum v0.1.0 进行分析，这是一个旨在通过利用预存的全面基因特征来量化巨噬细胞极化的计算框架。与依赖有限 M1/M2 标记物的传统方法不同，Spectrum 基于大规模转录组数据提供连续的极化评分，使我们能够准确表征胎盘微环境中母体和胎儿巨噬细胞的功能多样性和细微转录组变化。

跨组织分析的数据整合

两个外部数据集首先进行独立的原始数据预处理和下游分析，以表征 MO 影响下胎盘和胎儿肝脏的独特图谱。为了进一步探索 MO 如何通过胎盘影响胎儿肝脏免疫功能，我们整合了两个数据集。具体而言，来自胎盘和胎儿组织的单独 Seurat 对象使用典型相关分析 (CCA) 进行整合。识别整合锚点以将数据集对齐到共享流形中，有效校正技术批次效应和样本间差异。整合后，我们进行聚类和细胞类型识别。虽然组织特异性群体基于单独 (未合并) 的分析进行注释，但共享的免疫细胞群体使用整合数据集的聚类结果定义。这个整合框架作为后续母胎界面联合分析的基础。

细胞 - 细胞通讯分析

胎盘和胎儿肝脏之间的细胞 - 细胞通讯网络使用 CellChat (v2.1.2) 推断。利用了物种特异性配体 - 受体数据库 (小鼠)，并使用相应的蛋白质 - 蛋白质相互作用 (PPI) 网络细化分析以增强信号可靠性。为了确保胎盘和胎儿肝脏之间跨器官通讯的生物学合理性，我们专门将 CellChat 数据库子集化为仅包含“分泌信号”途径。“非蛋白质信号”、“细胞 - 细胞接触”和"ECM-受体”相互作用被手动排除，因为这些机制需要物理邻近或共享局部结构，而在器官间环境中不存在。使用来自每个实验组的归一化基因表达数据作为输入来计算通讯概率，阈值要求每个簇至少有 10 个细胞以确保统计稳健性。然后在途径水平上聚合这些相互作用，重点关注从胎盘细胞到胎儿肝脏细胞的方向性信号。最后，进行比较分析以识别组间差异通讯网络和信号途径。

细胞周期分析

细胞周期评分和分类使用 Seurat (v5.2.1) 进行。基于整合的小鼠经典细胞周期基因集，使用 CellCycleScoring 函数为每个单独细胞分配 S 和 G2/M 评分。细胞随后被分类为 G1、S 或 G2M 期。分期分配后，计算每个周期阶段的细胞比例以供进一步比较。

蛋白提取和蛋白质印迹法

组织样本在液氮中粉碎成细粉，并在 1× SDS 上样缓冲液 (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% 甘油，和 0.01% 溴酚蓝) 中以 1:10 (w/v) 比例匀浆。匀浆液补充 5% β-巯基乙醇，煮沸 5 分钟，并在 4°C 下以 12,000 g 离心 15 分钟收集上清液。蛋白通过 SDS-PAGE (4% 浓缩胶和 10% 分离胶) 分离，并在 100V 下电转至硝酸纤维素膜上 2 小时。在室温下用 5% 脱脂牛奶在 1× TBST 中封闭 1 小时后，膜在 4°C 下与以下一抗 (1:1,000 稀释) 孵育过夜：兔抗 Spp1 (E9Z1D; 货号# 88742, Cell Signaling Technology)、兔抗 Rbl2 (D9T7M; 货号# 13610, Cell Signaling Technology)、兔抗 TGFβ1 (货号# bs-0086R, Bioss) 和小鼠抗β-微管蛋白 (货号# E7, DSHB)。

随后，将膜在室温下与 IRDye 标记的二抗（1:15,000 稀释）孵育 1 小时，其中包括驴抗兔 IgG (800CW, 货号# 925–32213, LI-COR Biosciences) 和山羊抗鼠 IgG (680RD, 货号# 925–68180, LI-COR Biosciences)。使用 Odyssey 红外成像系统 (LI-COR Biosciences) 对蛋白条带进行显影和定量分析。

定量与统计分析
所有统计分析均使用 R (v4.5.1) 和 GraphPad Prism (v9.5.1) 进行。对于单细胞转录组数据分析，使用 Wilcoxon 秩和检验确定差异表达基因，校正后 p 值 <0.05 被认为具有统计学显著性。对于 Western blot 分析，蛋白条带强度经定量后以内参进行标准化。使用 Mann-Whitney U 检验评估两个独立组（CT vs. MO，每组 n ≥ 4）之间的统计差异。实验数据表示为均值 ± 标准误，p 值 <0.05 被认为表示具有统计学显著差异。

补充信息 (3)
下载全部 PDF (3.37 MB) 文档 S1：图 S1–S6 和数据 S1
电子表格 (12.19 KB) 表 S1：scRNA-seq 中用于细胞类型鉴定的标记基因
电子表格 (843.49 KB) 表 S2：推断的胎盘与胎儿肝脏之间的细胞间通讯网络