一种新型高度分支的半乳葡甘露聚糖的结构解析：该聚糖来自竹寄生真菌 Hypocrella bambusae，并具有通过 MAPK 途径介导的免疫刺激活性

《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》：Structural Elucidation of a Novel Highly Branched Galactoglucomannan from Bamboo Parasitic Fungus Hypocrella bambusae and Its MAPK-Mediated Immunostimulatory Activity

　　

摘要：

竹节菌（Hypocrella bambusae）是一种具有珍贵生物活性色素的特殊药用真菌，但其多糖成分尚未得到充分研究。本研究旨在探讨从竹节菌菌丝体中分离并纯化的异多糖（HB0-1）的结构，并评估其免疫调节活性。分析结果表明，HB0-1主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，具有(1→6)-α-D-甘露吡喃糖主链，侧链包含β-D-半乳呋喃糖、α-D-葡萄糖吡喃糖和β-D-半乳吡喃糖残基。在细胞实验中，HB0-1显著提高了RAW264.7巨噬细胞的存活率、吞噬活性、活性氧（ROS）的产生以及促炎细胞因子（白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌水平，同时增强了诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达。进一步的机理研究表明，HB0-1以浓度依赖的方式激活MAPK信号通路，从而增强免疫反应。这些结果说明，HB0-1高度分支的结构——其(1→6)-α-D-甘露聚糖主链上密集分布着富含葡萄糖和半乳糖的侧链（包括呋喃糖结构），是其强大的MAPK介导的巨噬细胞激活效应的原因。这种结构-功能关系使HB0-1成为功能性食品和治疗应用中的有前景的免疫调节候选物质。

引言

来自药用真菌的多糖因其结构多样性和广泛的免疫调节功能而受到广泛关注。它们的生物活性受分子量、单糖组成、分支密度和糖苷键合模式的影响（Wang等，2025年）。来自灵芝（Ganoderma）、毛菇（Lentinula）和冬虫夏草（Cordyceps）的经典β-葡聚糖能与模式识别受体（如Dectin-1和Toll样受体TLRs）相互作用，引发调节巨噬细胞激活、氧化反应和细胞因子产生的细胞内信号（Gu等，2025年）。

竹节菌（Hypocrella bambusae）是一种栖息在竹子上的子囊菌，通常在云杉或冷杉林中形成菌丝体，多生长在Sinarundinaria属植物的节间区域或嫩枝上。民族药典记载，当地治疗师常将干燥的菌丝体用于煎煮（Li等，2021年）。在中国西北部的传统医学中，这种真菌被认为具有“解毒、止痒、促进组织再生和溃疡愈合”的功效（Xiangyi，1985年；Wei，2008年）。作为一种被广泛研究的昆虫寄生真菌，竹节菌含有大量的苝醌色素和抗病毒代谢物。除了色素外，竹节菌还产生多种生物活性分子，包括多糖、甾醇和脂肪酸，这些成分被认为对其药理作用有所贡献（Xu等，2001年；Bian等，2023年）。

然而，尽管竹节菌有着悠久的传统使用历史，且其小分子代谢物也已被广泛研究，但其多糖成分从未被系统地进行过研究（Bushra & Nurul，2022年）。在本研究开始时，关于这种真菌多糖的分离和纯化方法、结构特征（如单糖组成、分子量、糖苷键合类型和分支模式）以及免疫调节机制的相关报道尚不存在，这一知识空白尤为突出。进行这项研究的科学依据和必要性体现在以下几个方面：首先，同一属及相关属的真菌多糖已被证明具有显著的免疫增强作用，包括促进巨噬细胞激活、诱导细胞因子分泌和调节MAPK信号通路（He等，2025年；Wang等，2018年），这表明竹节菌多糖也可能具有类似的生物活性。其次，“解毒”和“组织再生”等传统功效与免疫调节和组织修复密切相关，而多糖是许多药用真菌发挥这些治疗作用的主要生物活性成分（Elnahas等，2024年；Barbosa & Junior，2021年）；因此，系统研究其多糖成分对于阐明这种传统真菌的现代科学基础至关重要。第三，目前的真菌多糖研究主要集中在担子菌门（如灵芝Ganoderma lucidum、毛菇Lentinula edodes）（Cheng等，2023年；Jouybari等，2023年），而对昆虫寄生子囊菌的多糖结构和功能理解仍然非常有限（Osińska-Jaroszuk等，2015年）。作为子囊菌门中的代表性传统药用真菌，系统研究竹节菌的多糖将有助于扩展真菌免疫调节剂的结构和来源多样性。

为填补上述知识空白，本研究围绕三个核心目标展开。首先，我们采用多步骤纯化策略从竹节菌中分离并纯化多糖组分，并通过逐步酸水解、甲基化-GC-MS糖苷键合分析、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和一维及二维核磁共振（1D/2D NMR）光谱技术阐明其精细结构（Jia等，2024年；Turatbekova等，2024年）。其次，利用RAW264.7小鼠巨噬细胞作为体外模型，系统评估了该多糖对巨噬细胞的免疫调节作用，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）量化关键炎症细胞因子的分泌水平，全面评估多糖对巨噬细胞激活、吞噬功能、氧化应激和炎症反应的调节效果（Xu等，2020年）。最后，基于MAPK信号通路在巨噬细胞激活中的核心调节作用，我们通过Western blot分析检测了经多糖处理的巨噬细胞中关键蛋白质的磷酸化状态，从而确定该多糖是否通过MAPK信号通路激活巨噬细胞，并揭示其免疫调节作用的机制（Xie等，2022年）。

本研究发现了一种先前未表征的高度分支的甘露寡糖，其中含有吡喃糖和呋喃糖结构，证明HB0-1通过ERK/JNK/p38通路激活MAPK轴，从而强烈刺激巨噬细胞。值得注意的是，大多数已报道的冬虫夏草相关多糖为甘露半乳聚糖，其葡萄糖摩尔比相对较低（<20%）。相比之下，HB0-1的主要单糖为葡萄糖（约占70%），这在昆虫病原性子囊菌中较为罕见。这种组成差异提示HB0-1可能通过与担子菌不同的受体结合或触发不同的信号通路，进一步证明了对其结构和机制进行详细研究的必要性。这些发现为理解竹节菌的生物活性多糖提供了新的见解，并丰富了真菌免疫调节剂的结构多样性。

章节摘录

材料与试剂

竹节菌的干燥菌丝体从中国云南省昆明的商业供应商处购买。单糖标准品购自Alfa Aesar。1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP，99%）由ACROS Organics提供。中性红染料购自Aladdin Reagent Co., Ltd.（中国杭州）。细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8）购自Solarbio Science & Technology Co., Ltd.（中国北京）。比色蛋白测定试剂盒（Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit）同样来自该公司。

多糖的提取与纯化

热水提取后经乙醇沉淀得到粗多糖组分。阴离子交换色谱分离出四个亚组分（HB0、HB0.1、HB0.25、HB0.5，见图1a），其中HB0为主要含碳水化合物的组分。进一步通过Sephacryl S-200尺寸排阻色谱分离得两个对称峰，分别命名为HB0-1和HB0-2。

HB0-1和HB0-2的理化性质测定

纯化后的HB0-1和...

结论与讨论

通过NMR、FT-IR和甲基化GC-MS的综合结构分析，确定HB0-1是一种高度分支的中性异多糖。其主链由(1→6)-α-D-Mannp-(1→结构组成，每隔一个甘露糖残基的O-2位置发生取代。这三个分支点上连接有三种类型的侧链：(1) β-D-Galf-(1→2)-β-D-Galf-(1→6)-β-D-Galf-(1→；(2) β-D-Galf-(1→3)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→3,6)-α-D-Glcp-(1→；(3) 一个末端β-D-Glcp-(1→。HB0-1的结构特征为...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

作者贡献声明

谢增峰：撰写初稿、方法学设计、数据整理。张雷芳：指导、概念框架制定。陈妍：资源提供。陈音：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金筹集。牛春宇：资源支持。应正伟：方法学研究。王 Lingyan：实验研究。

Barbosa, 2021; Chen等，2023; Ding等，2023; Li等，2023; Wang等，2023; Wang等，2023; Wang等，2023; Zhang等，2024.

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国浙江省自然科学基金（LTGS23D060001和LGN20C200003）、浙江省医学科技项目基金（2024KY1773）以及浙江海洋大学-金龙石油天然气大学-企业联合实验室的“挑战与响应项目”（12014260525016）的支持。

谢增峰 | 王 Lingyan | 应正伟 | 方琼燕 | 奈春宇 | 陈妍 | 张雷芳 | 陈音浙江省海洋大学食品与药学院，中国舟山市南海路1号，316000