《Food Bioscience》：A quinoxyfen immunochromatographic strip enabled by rational hapten design for rapid detection of quinoxyfen residues in agricultural products
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摘要喹啶 (QXY) 是一种持久性且具有生物累积性的杀菌剂，人们对食品安全和环境健康日益担忧，但缺乏可现场部署的检测方法。在此，我们报告了一种基于计算机辅助分子模拟理性设计的半抗原 (QXY-1)，该半抗原保留了 QXY 的核心结构和静电特征，诱发了高质量的免疫反应。生成了一
摘要
喹啶 (QXY) 是一种持久性且具有生物累积性的杀菌剂，人们对食品安全和环境健康日益担忧，但缺乏可现场部署的检测方法。在此，我们报告了一种基于计算机辅助分子模拟理性设计的半抗原 (QXY-1)，该半抗原保留了 QXY 的核心结构和静电特征，诱发了高质量的免疫反应。生成了一种高特异性的单克隆抗体 (mAb 4E10)，其 IC50 为 45.67 ng/mL，且对结构相关的类似物几乎没有交叉反应。使用该抗体，我们开发了首个基于胶体金的免疫层析检测 (CG-ICA) 用于 QXY 检测，能够在 10 分钟内实现视觉半定量和基于仪器的定量读出。该检测在缓冲液中的视觉检出限为 20 ng/mL，在葡萄中为 0.10 mg/kg，在生菜中为 0.05 mg/kg，截断值分别为 5 mg/kg 和 2 mg/kg。加标样品的回收率范围为 86.1% 到 109.3%，且结果与盲测市场样品中的 LC-MS/MS 结果相关性良好。除了提供现场 QXY 监测的实用工具外，这项工作还确立了一种计算机辅助理性半抗原设计策略，可推广用于开发其他挑战性小分子污染物的敏感免疫分析。
引言
喹啶 (QXY) 是一种苯氧基喹啉类杀菌剂，广泛用于防治葡萄、瓜类和谷物的白粉病 [1], [2], [3]。它通过抑制真菌病原体的附着胞形成和信号转导起作用 [4]，在保障作物产量方面发挥着关键作用 [5]。在结构上，喹啉核心激发了进一步的化学探索，导致了具有抗癌[6] 或改进抗真菌活性[7] 的衍生物。然而，人们对 QXY 的担忧超出了其靶向效力。该化合物具有高度亲脂性，在环境中持久存在（田间半衰期长达数月 [8], [9]），并在水生生物中生物累积[10]。其在水体中的存在受水文事件影响[11]，越来越多的证据指向多种不良影响：QXY 作为芳基烃受体激动剂起作用[12]，导致斑马鱼幼虫颅面畸形和神经发育毒性[13]，并改变农田猛禽的肠道微生物群[14]。在生态系统层面，它损害水生真菌对落叶的分解[15] 并持续存在于花粉中，对传粉者构成直接威胁[16]。这些发现共同引发了对其更广泛生态和健康影响的担忧[17]。
作为回应，监管机构采取了行动。欧盟将 QXY 归类为优先有害物质，并于 2019 年禁止其使用[18]，根据第 396/2005 号条例，将大多数植物产品的默认最大残留限量 (MRLs) 设定为 0.01 mg/kg。同样，中国的 GB 2763-2026 根据作物不同，设定 MRLs 范围为 0.01 到 0.5 mg/kg。执行这些限量需要可靠的监测方法。目前，QXY 检测依赖于 GC-MS、LC-MS/MS 和 SPME-GC-MS [8], [10], [19], [20] 等仪器技术。虽然这些方法灵敏，但成本高、操作复杂，且不适合现场筛查[21]。尽管先进材料[22] 和流化学技术[23] 改善了基于实验室的分析，但 QXY 的简单、快速且可现场部署的测试仍然缺乏。使用胶体金 (AuNPs) 的侧向流动免疫层析试纸条为现场检测小分子污染物提供了有希望的替代方案[21]。基于多克隆抗体的小分子污染物免疫分析很方便，但通常存在批次间变异性大和特异性不足的问题，限制了其实际效用 [24]。对于 QXY，已报道了一种 LOQ 为 60 μg/L 的多克隆 ELISA[25]。相比之下，单克隆抗体 (mAbs) 提供一致的亲和力和可扩展的供应，使其成为免疫分析开发的优越试剂。为了获得 QXY 的这种试剂，我们采用计算机辅助分子模拟来指导适当半抗原的选择和理性评估——这是一种策略，保留了目标的核心结构和静电特征以诱发特异性免疫反应[26]。尽管已报道 QXY 的多克隆 ELISA，但既没有文献记录特定的单克隆抗体，也没有基于胶体金的试纸条测试，这促使了当前的研究。
在此，我们通过报告一种用于现场 QXY 检测的灵敏且特异的基于胶体金的免疫层析试纸条来弥合这一差距。我们设计了一种新型半抗原，生成了高特异性的单克隆抗体，并系统地优化了检测参数。所得试纸条在葡萄和生菜样品上进行了验证，为监管监测和食品安全监视提供了一种实用的、用户友好的工具。
章节片段
材料与试剂
喹啶、喹螨醚、氟啶唑、氟噻唑菌胺、灭草胺和喹啶草酮购自莱亚试剂。N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、1-乙基 -3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)、帽贝血蓝蛋白 (KLH)、牛血清白蛋白 (BSA)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自 Sigma-Aldrich。硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸收垫和 PVC 底板购自上海金标生物科技有限公司。
QXY 半抗原的预测与分子设计
本研究侧重于制备针对 QXY 的单特异性单克隆抗体，其中合理的半抗原布局是获得理想免疫反应的关键前提。原则上，用于单靶标识别的半抗原应完全保留 QXY 的固有空间框架和表面物理化学性质，同时避免可能引发非特异性免疫识别干扰的额外结构片段[35]。
在半抗原合成之前，衍生化于
结论与讨论
总之，本研究通过计算机辅助的理性半抗原设计策略，解决了 QXY 免疫学检测方法和高性能工具长期缺乏的问题。在候选半抗原中，由于 QXY-1 具有与 QXY 高度结构相似性、静电兼容性和尺寸匹配性，被选为最优，有效地保留了目标分子的核心活性部分，同时诱发了强烈的免疫反应。使用 QXY-1-KLH 作为免疫原和 QXY-1-BSA
利益冲突声明
作者确认，与本手稿描述的工作没有利益冲突。
CRediT 作者贡献声明
徐传来: 写作 – 审阅与编辑，资金获取。 郭玲玲: 写作 – 审阅与编辑，项目管理，资金获取。 钱凯: 调查，资金获取，概念化。 王雪清: 写作 – 初稿，数据管理。 朱鹏飞: 方法论，形式分析。 刘力强: 软件，资源。 宋珊珊: 可视化，验证。 匡华: 写作 – 审阅与编辑，监督
数据可用性
本研究中生成和分析的数据集可根据合理请求向通讯作者获取。
符合伦理标准
本文不包含任何涉及人类受试者的研究。所有动物研究均在江南大学动物福利委员会的指导下进行。
利益冲突声明
? 作者声明，没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文报告的工作。
致谢
本工作获得江苏省市场监督管理局科技计划 (KJ2025008) 和 国家自然科学基金 (22404066, 22236002) 的资金支持。
钱凯 |王雪清 |朱鹏飞 |刘力强 |宋珊珊 |匡华 |徐传来 |郭玲玲
国家市场监督管理总局食品接触材料安全重点实验室，江苏省产品质量监督检验研究院，中国江苏省南京市 210007
