《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Tissue-specific transcriptomic responses and skeletal-muscle ultrastructural observations in Semah mahseer (
Tor douronensis) under acute thermal and hypoxic conditions
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Semah mahseer（Tor douronensis）是一种原产于东南亚的高价值淡水鲤科鱼类。本研究在急性热高温（35 °C）、低氧（溶解氧2 mg/L）或其组合暴露6小时后，研究了肝脏和白色骨骼肌中的转录组响应。32个RNA-seq文库获得了约48,5
Semah mahseer（Tor douronensis）是一种原产于东南亚的高价值淡水鲤科鱼类。本研究在急性热高温（35 °C）、低氧（溶解氧2 mg/L）或其组合暴露6小时后，研究了肝脏和白色骨骼肌中的转录组响应。32个RNA-seq文库获得了约48,504个注释的unigenes。相对于对照组，热高温在肝脏中产生了7,776个差异表达基因（DEGs），在肌肉中产生了1,121个；低氧分别产生了2,451和318个DEGs；组合暴露分别产生了4,952和717个DEGs。响应涉及热休克蛋白、内质网蛋白质加工、糖酵解和氧感知通路、线粒体和收缩程序以及凋亡相关信号传导。通过qRT-PCR比较了20个选定转录本的表达方向；报告的跨平台相关性为r = 0.91，尽管解释仍取决于参考基因稳定性的验证。定性扫描电子显微镜显示，在应激处理下，骨骼肌组织的区域依赖性破坏。由于本研究仅使用一个急性终点、每个条件两个重复水箱、一个从头转录组，并且未进行直接的死后肉质测量，因此研究结果应被解释为需要独立验证的机制性假设。
**论文解读**
**1. 研究背景**
全球变暖导致热浪频率增加，同时伴随着水体溶解氧下降，这对淡水生态系统构成了严峻挑战。在热带和亚热带地区，水温可能接近或超过鱼类的耐受极限，而养殖池塘和天然水库中增加的生物需氧量和降低的氧溶解度可能诱发夜间低氧。热高温和低氧单独或协同作用，会损害养殖和野生鱼类的生长、免疫能力和有氧代谢。因此，从分子水平上理解高价值鱼类如何感知、整合和响应这些环境胁迫因子，对于改善胁迫管理、维持水产养殖生产力以及增强对气候变化的适应性至关重要。
Semah mahseer（Tor douronensis）是一种在泰国、越南、马来西亚和印度尼西亚具有重要经济价值的濒危物种，其自然栖息地通常为相对凉爽、溶氧充足的水域。然而，目前对该物种如何响应典型环境胁迫因子的机制性数据远少于模式硬骨鱼类和广泛养殖的鲤鱼。已知在其他鱼类中，低氧激活低氧诱导因子信号并转向糖酵解ATP生产，而热应激则迅速激活伴侣蛋白系统、蛋白质质量控制及氧化应激防御。然而，这些经典响应在T. douronensis中是否发挥作用，以及它们如何与影响鱼类性能和肉质的重要组织相互作用，仍是未知的。
水产养殖性能与骨骼肌和肝脏的生理状态密切相关，两者均是环境胁迫的重要靶点。肌肉是主要的可食用部分，其质地、颜色、持水力以及死后生化轨迹决定了加工产量和货架期。肝脏则协调急性期免疫、解毒、全身能量分配以及支持肌肉收缩和恢复的底物供应。在胁迫条件下，任一组织的紊乱都会降低生长速率和饲料效率。低溶解氧和高温在水环境中经常同时发生，由于热量增加代谢需氧量而低氧减少供氧量，因此它们的共同作用可能产生叠加效应，加剧蛋白质错误折叠、活性氧产生和线粒体功能障碍，从而触发包括未折叠蛋白响应、脂质和碳水化合物代谢重编程、膜组成重塑以及通过自噬和泛素-蛋白酶体系统调控蛋白质稳态在内的补偿性响应。
高分辨率转录组学可以绘制与热、低氧及其组合暴露相关的组织特异性和共享基因网络，这些数据能够识别候选分子标记并产生关于胁迫抗性和肌肉生物学的假设。本研究的主要目标是描述T. douronensis在对照、低氧、热高温或热高温-低氧组合条件下肝脏和白色骨骼肌的组织特异性转录组响应，次要目标是利用扫描电子显微镜（SEM）定性描述骨骼肌超微结构。
**2. 主要关键技术与方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：（1）**RNA-seq转录组测序**：构建了32个文库（来源于4个处理组×2个重复水箱×2条鱼/水箱×2个组织），在Illumina平台上进行配对末端测序，以获取全局基因表达谱。（2）**从头转录组组装与功能注释**：因缺乏T. douronensis完整参考基因组，使用Trinity软件进行从头组装，并对组装的unigenes与NR、Pfam、Swiss-Prot、KEGG、GO等多个数据库进行功能注释。（3）**差异表达基因（DEG）分析与功能富集**：使用DESeq进行差异表达分析，并通过Gene Ontology（GO）和KEGG通路富集分析来解析DEGs的生物学功能；同时利用蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络探索DEGs间的功能关联。（4）**qRT-PCR验证**：使用QuantiNova SYBR Green PCR技术在AriaMx Real-Time PCR系统上对20个候选生物标记物进行验证，以评估RNA-seq数据的可靠性。（5）**扫描电子显微镜（SEM）**：在Hitachi SU-3800扫描电子显微镜下，对背、腹、尾柄三个区域的骨骼肌进行定性的超微结构观察。所有实验鱼样本来源于泰国也拉府勿洞县的一个当地养殖场，并在泰国农业大学水产动物健康管理卓越中心完成驯化和实验。
**3. 研究结果**
**3.1. 对热和低氧挑战的生理响应**
通过6小时急性暴露后的行为观察发现，对照鱼保持正常，而热应激（HT）鱼表现出早期鳃盖运动增加，后期游泳活动减少。低氧（HPX）组鱼表现出呼吸代偿，如增加鳃盖运动和在富氧区域停留。组合胁迫（HTPX）组表现出最严重的生理和行为紊乱，包括快速鳃盖运动、游泳能力下降、平衡失调和极度嗜睡，严重程度超过单独胁迫。
**3.2. RNA-seq数据质量和从头转录组功能注释**
32个RNA-seq文库共产生约48,504个注释unigenes。与8个数据库的比对结果表明，核心注释基因为3,307个，KEGG和KOG注释提供了额外的深度。
**3.3. 差异表达基因（DEGs）的识别**
主成分分析（PCA）和样本相关性分析显示，肝脏和肌肉的转录组程序存在显著分离。在肝脏中，热高温诱导了最强烈的转录响应（7,776个DEGs），组合胁迫次之（4,952个DEGs），低氧最温和（2,451个DEGs）。在肌肉中，总体DEGs数量较少，但同样以热高温诱导最多（1,121个DEGs），组合胁迫次之（717个DEGs），低氧最少（318个DEGs）。这表明肝脏表现出更广泛的转录重编程，而肌肉的转录调整更为保守，且热高温是基因调控的主要驱动因素。
**3.4. 每个组织中的关键转录组特征和蛋白互作网络**
**肝脏：** 热高温引起最广泛的转录重编程，上调了hsp70、hsp90、dnaJ同源物和sod等与蛋白质质量控制及抗氧化防御相关的基因，下调了fasn、acc和核糖体蛋白基因，表明脂质生物合成和翻译活性受到抑制。低氧上调了血红蛋白α/β亚基和糖酵解酶（如aldolase a, gapdh），下调了细胞色素c氧化酶亚基和核糖体蛋白基因，表明有氧代谢受损。组合胁迫上调了irak4、C型凝集素和gst，表明先天免疫与抗氧化防御协同激活，同时下调了核糖体蛋白和延伸因子等参与蛋白质合成的基因。
**肌肉：** 热高温强烈诱导了伴侣蛋白（hsp90, hsp70）和凋亡相关基因（casp3），下调了原肌球蛋白、肌钙蛋白t和细胞色素c氧化酶亚基，表明收缩和线粒体过程发生改变。低氧上调了血红蛋白β和糖酵解酶（如ldh-a），下调了肌球蛋白重链和ATP合酶β，表明结构完整性受损和氧化磷酸化受抑。组合胁迫上调了泛素结合酶E2、casp8和hsps，下调了琥珀酸脱氢酶亚基a和肌钙蛋白t，表明同时存在线粒体功能障碍和收缩损伤。
**组织特异性与共享网络：** 肝脏特异性DEGs（如叉头框蛋白Q1-like）强调转录调控和伴侣功能，而肌肉特异性DEGs（如sepiapterin reductase-like）突出蛋白质稳态和线粒体能量调控。上调的共享基因主要为伴侣蛋白（如hsp70），表明保守的蛋白质维稳反应。组织间反向调控的基因（如ZDHHC23）则揭示了蛋白质修饰、泛素处理和代谢储存方面的组织特异性权衡。
**3.5. 蛋白质加工与胁迫相关通路**
**未折叠蛋白反应（UPR）通路：** 在肝脏和肌肉中，尤其在热高温和组合胁迫下，与PERK-eIF2α-ATF4、ATF6和IRE1-XBP1三个经典UPR分支相关的基因（如perk, atf4, atf6, ire1, xbp1）以及内质网伴侣蛋白（如calr, hsp90b1, hspa5）表达出现差异，表明内质网蛋白质折叠能力得到增强。同时，chop, traf2, ask1等基因的变化提示了应激和凋亡信号的参与。
**内质网相关降解（ERAD）通路：** 在肝脏热高温和组合胁迫下，参与错误折叠蛋白识别、逆向转运和泛素化的ERAD相关基因（如os9, edem, derlin, sec61, sel1l, chip）表达上调，表明为清除不可逆损伤的蛋白，清除机制被激活。
**凋亡通路：** 与外在凋亡（trail, fasl, fadd, casp8）、内在线粒体凋亡（bax, bak, bcl2, bcl-xl, cycs, casp9）以及内质网应激相关凋亡（perk, atf4, chop, casp12）的转录本均出现差异表达，表明急性胁迫下凋亡信号模块被广泛调控。
**3.6. qRT-PCR验证**
qRT-PCR验证了RNA-seq结果，在HTPX组中，挑选的蛋白质稳态相关基因（如hsp70）在肝脏和肌肉中均上调，而代谢和凋亡相关基因（如apoa1, cpt1a）下调。RNA-seq和qRT-PCR之间的表达变化方向高度一致，Pearson相关系数为r = 0.91，验证了RNA-seq数据的可靠性及所选候选基因作为胁迫响应生物标记物的有效性。
**3.7. 热、低氧及其组合对骨骼肌超微结构的影响**
定性SEM观察显示，胁迫处理组的背、腹、尾柄三个区域的骨骼肌出现了区域依赖性的组织破坏，包括肌原纤维收缩、肿胀或萎缩、纤维解离、肌膜和肌内膜断裂以及肌纤维间隙增宽，其中组合胁迫组的损伤最为严重。
**4. 讨论与结论**
讨论部分指出，行为观察和转录组分析均表明，急性热、低氧及其组合对T. douronensis构成了生理胁迫。热高温是转录组重塑的主要驱动因素，而低氧单独作用时转录响应相对有限。组合胁迫诱导了独特的响应模式，但并未产生比热高温更多的全局DEGs，因此不能推断为协同效应。肝脏展现出多层次的防御（UPR、ERAD、抗氧化和先天免疫受体），而肌肉则表现为收缩和线粒体蛋白的抑制以及凋亡的激活，体现了组织特异性响应。与鲑鱼和卵形鲳鲹等物种的比较表明，蛋白质稳态、凋亡信号、氧化应激调控和代谢再分配是鱼类对热和低氧胁迫的普遍响应。
**研究结论（翻译原文结论部分）：**
急性热高温和低氧与Semah mahseer的组织特异性转录组模式相关。肝脏响应强调蛋白质稳态和代谢再分配，而肌肉响应涉及伴侣蛋白、线粒体、收缩和凋亡相关转录本。热高温产生了最多的DEGs，组合胁迫显示出一种独特但未被证明具有协同性的模式。定性的SEM观察产生了关于胁迫相关骨骼肌组织的假设，但未测量直接的肉质终点。关键局限性包括单一6小时时间点、单一温度和溶解氧水平、缺乏恢复组、每个条件两个重复水箱、水箱内鱼样本的嵌套、单一种群和体型等级、未确定性别、从头组装、暂定的qRT-PCR标准化以及缺乏定量的SEM形态计量。因此，这些发现支持未来的机制性和养殖研究，但未建立对死后肉质的影响。论文发表在《Food Chemistry: Molecular Sciences》。
