非靶向代谢组学揭示乳酸菌发酵对‘Munage’葡萄汁的影响

《Food Chemistry: X》：Untargeted metabolomics reveals the impact of lactic acid bacteria fermentation on ‘Munage’ grape juice

　　

本研究旨在筛选高产胞外多糖（EPS）的乳酸菌，并系统表征Munage葡萄汁（MGJ）混合发酵过程中的时间代谢动态。研究人员从十株商业菌株中逐步筛选出嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），并以1:1比例进行共发酵。采用响应面法（RSM）确定最佳发酵参数：接种量2.5%（v/v），初始pH 5.9，温度37?°C，发酵时间32?h。在这些条件下，EPS产量达到1.26?±?0.02?g/L。非靶向代谢组学分析揭示了明显的时间代谢重编程。在早期阶段（0–16?h），丙酮酸代谢途径显著富集，导致有机酸（乳酸、柠檬酸）快速积累，从而降低pH并抑制有害微生物。在中期阶段（16–32?h），苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代谢及相关途径协同激活，导致酚酸（香豆酸、异丁香酚）、黄酮类化合物和氨基酸衍生物（N-乙酰谷氨酸、His-Trp-Phe）水平显著增加，从而赋予增强的抗氧化活性和风味前体。在后期阶段（32–40?h），代谢活性趋于平稳，仅观察到少数差异代谢物，证实32?h为最佳发酵终点。本研究首次提供了MGJ中混合乳酸菌（LAB）发酵的全面时间代谢图谱，为功能性发酵饮料的开发提供了技术参数和理论支持。

**论文解读：非靶向代谢组学揭示乳酸菌发酵对‘Munage’葡萄汁的代谢重塑机制**

**1. 研究背景与问题**

‘Munage’葡萄（Vitis vinifera L. cv. Munage）是中国新疆喀什地区特有的晚熟鲜食葡萄品种，以果粒大、甜度高、香气独特著称，富含糖类、有机酸、酚类化合物和维生素。然而，其果皮薄，采后易失水、萎蔫、褐变和腐烂，加之采收期集中（8–10月）及冷链设施不足，导致采后损失严重，限制了市场价值。因此，开发新型加工策略以提升资源利用率具有重要现实意义。现有研究多聚焦于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或特定酿酒工艺，而对乳酸菌（LAB）介导的Munage葡萄汁（MGJ）发酵关注甚少。与葡萄酒中苹果酸-乳酸发酵（一种在酒精发酵后进行的二次降酸步骤）不同，研究人员采用纯LAB发酵（不添加酿酒酵母）生产巴氏杀菌功能性饮料，使发酵衍生的代谢物（如胞外多糖（EPS）、有机酸和生物转化酚类）成为产品品质和功能性的主要贡献者。LAB发酵能赋予产品特征酸味和发酵风味，同时产生EPS等生物活性代谢物，提升营养价值和感官品质。然而，目前缺乏系统性的代谢组学研究来揭示LAB发酵MGJ过程中的代谢动态，也尚未建立涵盖高产EPS菌株筛选、混合发酵优化及非靶向代谢组学机制解析的整合研究框架。因此，本研究旨在从十株商业菌株中筛选高产EPS且具有强抗氧化和降胆固醇能力的乳酸菌，构建最优混合发酵组合，通过单因素实验和响应面法（RSM）优化发酵工艺，并利用非靶向代谢组学系统表征混合发酵过程中MGJ的时间代谢重编程，为MGJ的增值发酵加工提供理论和技术支持。

**2. 主要技术方法**

研究人员采用逐步筛选策略，以EPS产量、总抗氧化能力（T-AOC）和降胆固醇能力为功能性指标，从十株商业乳酸菌中筛选出高产菌株。筛选出的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum，LP）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA）以1:1比例共发酵。通过单因素实验和Box–Behnken设计（BBD）的响应面法（RSM）优化发酵参数（接种量、初始pH、温度、时间）。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）进行非靶向代谢组学分析，样本来源为新疆阿图什市的Munage葡萄和北京博威生物科技有限公司的菌株。代谢组学数据经主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行多元统计分析，基于VIP≥1、p<0.05、|log₂ fold change|≥1筛选差异代谢物，并通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行通路富集分析。

**3. 研究结果**

**3.1. 菌株筛选与混合培养构建**
**3.1.1. 逐步筛选功能性乳酸菌**
通过EPS产量初筛，所有菌株均显著高于未发酵对照（p<0.05），其中LP、发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum，LF）和酸片球菌（Pediococcus acidilactici）产量最高，淘汰低于平均值一个标准差（<0.94?g/L）的菌株。T-AOC二次筛选中，LP和LF抗氧化活性最强，与排名前50%的菌株一起保留。降胆固醇能力终筛中，LA去除率最高（40.01%），显著高于LF（36.91%）和LP（36.01%），因而确定LP、LA和LF为核心功能菌株。

**3.1.2. 混合培养比例优化**
通过比较不同比例组合的EPS产量和活菌数，发现LP:LA（1:1）共培养的EPS滴度最高，显著超过所有单菌及其他混合组合（p<0.05），且活菌数稳定，表明存在协同效应。含LF的组合EPS产量降低，提示竞争抑制，因此确定LP:LA（1:1）为最优比例。

**3.1.3. 单菌发酵的理化动态**
监测LP和LA单菌发酵过程中pH、可溶性固形物（TSS）和滴定酸度（TA）的时间变化。两者TSS在8?h内快速下降，但pH和TA动态不同：LP的pH持续下降，TA稳步上升至40?h；LA的pH在12?h内相对稳定后骤降，TA在24?h后积累并在32?h达峰。两种菌均在约32?h进入稳定期，此时EPS合成和活菌数最高，故确定32?h为后续代谢组学分析的最佳发酵终点。

**3.2. 混合发酵优化**
**3.2.1. 单因素实验**
单因素实验显示，EPS产量在初始pH 5.5时最高，活菌数在pH 5.0–6.0持续增加；接种量3%–4%时EPS产量稳定；温度37?°C时EPS产量和活菌数均最大，40?°C时急剧下降；发酵时间30?h时两者同时达峰。据此设定RSM优化范围：初始pH 5.0–6.0，接种量3%–5%，温度34–40?°C，时间24–36?h。观察发现活菌数在pH 4.5和5.5–6.0出现双峰，可能与两株菌的pH生长最适差异有关；EPS产量在1:1比例下最高，且与活菌数趋势不一致，提示EPS合成部分独立于生长，可能由LA的pH适应优势、种间协同及代谢权衡共同驱动。

**3.2.2. 响应面优化与模型验证**
基于BBD建立EPS产量的二次多项式模型，方差分析显示模型极显著（p<0.001），失拟不显著（p=0.1952），R²=0.9212，调整R²=0.8415。预测最优条件：接种量2.534%，初始pH 5.908，温度37.606?°C，时间31.832?h。实际采用参数：接种量2.5%（v/v，10⁹?CFU/mL），初始pH 5.9，温度37?°C，时间32?h，预测EPS产量1.31?g/L。三次验证实验实测EPS产量1.26±0.02?g/L，相对误差3.9%，模型可靠。与单菌相比，混合发酵EPS产量较LP提高121.46%，较LA提高184.76%，活菌数维持在2.18×10⁹?CFU/mL，证实协同效应。

**3.3. 非靶向代谢组学分析**
UPLC-QTOF-MS分析共鉴定3100个代谢物（正离子模式2000个，负离子模式1100个）。PCA显示前两个主成分解释总变异的64.0%（PC1: 42.3%，PC2: 21.7%），组间分离不完全但存在生物学变异。OPLS-DA清晰区分发酵组与对照组（R²Y=0.999，Q²=0.944），置换检验（n=200，p<0.005）验证模型稳健。代谢物分类以氨基酸及其衍生物（33.7%）、有机酸（13.9%）和苯环取代化合物（10.1%）为主。比较HJ-32?h组与CK组，共鉴定765个差异代谢物（347个上调，418个下调），32?h时差异代谢物数量最多，涵盖了关键代谢转变和功能成分积累。上调物主要为氨基酸/衍生物、有机酸和酚酸；下调物主要为脂类和核苷酸/衍生物，反映LAB蛋白酶活性释放游离氨基酸，有机酸增加与pH下降和TA升高一致，酚酸富集证实苯丙烷途径激活。

**3.3.1. 时间代谢动态**
早期（0–16?h）：315个上调、299个下调代谢物，有机酸（乳酸、柠檬酸）显著增加，嘌呤/嘧啶衍生物减少，KEGG富集显示丙酮酸代谢和氨基酸生物合成途径显著激活，符合LAB适应-生长期特征。中期（16–32?h）：16?h vs 24?h比较显示247个上调、178个下调代谢物，酚酸、黄酮类和多胺增加，KEGG富集苯丙烷生物合成和谷胱甘肽代谢途径，同时芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）积累作为酚类抗氧化前体。32?h vs 24?h比较差异代谢物急剧减少（48个上调、186个下调），仅精氨酸/脯氨酸代谢弱富集，表明进入稳定期，代谢活性降低，与理化数据中EPS和活菌数在32?h达峰一致。后期（32–40?h）：差异代谢物进一步减少，无显著富集通路，表明进入衰亡期，产品成分稳定。环形热图直观展示代谢转变：早期有机酸和核苷酸变化为主，中期酚类、黄酮类和氨基酸衍生物积累，后期脂类轻微波动。全局KEGG通路分类显示氨基酸代谢（20.83%）、脂质代谢（19.79%）和次生代谢物生物合成（16.67%）为前三类。动态p值热图显示丙酮酸代谢、苯丙烷生物合成和氨基酸生物合成在16–24?h富集最强，32?h后减弱，40?h无显著富集，进一步支持32?h为最佳发酵终点。

**3.3.2. 最优时间点（32?h）的代谢特征**
32?h时PCA共解释78.75%的变异（PC1: 67.44%，PC2: 11.31%），组间完全分离且生物学重复紧密。765个差异代谢物中，下调物主要为核苷酸衍生物，反映核酸合成减弱及代谢转向次生代谢；上调物中氨基酸衍生物（如N-乙酰谷氨酸、His-Trp-Phe、Pro-Leu-Cys）可作为氮源和风味前体；有机酸（如琥珀酸酐、3-羟基十二酸、3-羟基异戊酸）积累与pH下降和TA升高一致，贡献清爽酸味和抑菌；苯衍生物（如3-苯氧基丙酸、1-羟基-2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-9,10-蒽醌）和黄酮类（如槲皮万寿菊素）增加表明苯丙烷代谢激活，直接解释发酵后总酚含量和抗氧化活性增强；多元醇（如甘露醇、景天庚酮糖）积累可能赋予温和甜味和改善口感。KEGG富集分析识别92条通路，14条显著（p<0.05），包括氨酰-tRNA生物合成、核苷酸代谢、谷胱甘肽代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、精氨酸/脯氨酸代谢、苯丙烷生物合成和丙酮酸代谢。通路网络分析显示这些通路以丙酮酸-氨基酸代谢枢纽为中心，向外延伸至苯丙烷合成（功能成分）、精氨酸/脯氨酸代谢（胁迫耐受）、谷胱甘肽代谢（抗氧化防御）和核苷酸代谢（生长增殖），核心代谢物在多个通路间共享，最大化底物利用效率。聚焦三条核心通路（苯丙烷生物合成、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢），发现丙酮酸代谢驱动碳水化合物分解为有机酸（pH降低、风味形成），同时为氨基酸合成提供碳骨架和能量；氨基酸生物合成作为中枢，提供生长所需氮源并合成芳香族前体（苯丙氨酸、酪氨酸）供给苯丙烷途径；苯丙烷生物合成作为下游效应器，将前体转化为酚酸和黄酮类，直接增强抗氧化和健康促进特性。时间动态显示苯丙氨酸和酪氨酸从16?h开始持续升高，32?h达峰，驱动对香豆酸和异丁香酚平行积累，直接解释抗氧化活性增加。在最优条件下，混合发酵使总酚增加33.17%。氨基酸生物合成中间体（苏氨酸、色氨酸）在16–24?h快速积累，提供风味前体。丙酮酸代谢中的有机酸（乳酸、柠檬酸）持续积累至32?h，驱动pH下降并抑制污染物。32?h后无显著变化，40?h略有下降，进一步验证32?h为最佳发酵终点。

**4. 结论与讨论**

本研究建立了以植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为混合发酵剂的MGJ优化发酵工艺，证实了二者在EPS合成上的显著协同增强作用。时间非靶向代谢组学首次系统揭示了分阶段代谢重编程：早期碳代谢激活，中期苯丙烷和氨基酸代谢协同激活驱动功能成分积累，32?h后代谢趋于稳定。苯丙烷生物合成途径的时间激活为FMGJ抗氧化活性增强提供了直接代谢证据。本工作为Munage葡萄汁的功能性发酵提供了技术参数和机制见解。由于微生物相互作用机制仅从代谢组学推断，未来需整合宏转录组学以解析LP和LA之间的分子互作网络，实现精准发酵控制。