基于可见光图像的非破坏性低成本燕麦成熟叶叶绿素估算方法界定燕麦持绿性状

《Frontiers in Agronomy》：Image-based non-destructive, low-cost chlorophyll estimation method for oat mature leaves defines oat stay-green traits

　　

引言：持绿（Stay-green, SG）表型通常以叶片衰老延迟和叶绿素滞留时间延长为特征。然而在作物成熟期，视觉性状趋同与环境变异常限制单纯叶色绿度区分SG与晚熟（Late-maturing, LM）表型的有效性。方法：本研究采用可见光图像分析，评估穗色性状补充叶部性状、提升成熟期SG与LM燕麦类型表型分辨的潜力。在统一成像条件与最小环境控制下，从三种燕麦成熟类型叶片与穗部提取颜色指数。结果：叶源颜色指数（ExG、GLI、G/R、Hue）与实测叶绿素含量呈稳定强相关，表明即便使用非专用成像设备与简化流程，这些指数仍可作为叶绿素的可靠替代指标。尽管穗部结构与光学更复杂，穗源颜色指数仍呈现与叶叶绿素状态一致的清晰梯度；当成熟期SG与LM材料叶色指数部分重叠时，引入穗色信息有效提升了表型分辨力。讨论：综上，燕麦持绿定义应强调器官成熟异步性，即穗已达表观成熟态时叶片仍维持可测绿度。本研究凸显了低成本基于图像的颜色指数作为田间相关条件下稳健表型化实用工具的潜力，尤其在难以精确控环或破坏性测量的场景。

研究背景与立项依据：持绿（Stay-green, SG）作为调控作物衰老的关键表型性状，与生殖后期光合功能维持、灌浆稳定性及胁迫耐受性密切相关。在小麦、玉米、水稻等谷物中，SG常用来解释成熟期叶绿素滞留与产量或品质的关系，被视为具育种潜力的功能性状。然而成熟期SG的表型阐释仍具挑战：绿度滞留可能源于功能性衰老延迟，也可能源于发育进程延迟。实践中SG通常依成熟期绿叶滞留程度识别，而晚熟（Late-maturing, LM）材料因整体发育推迟，成熟期同样表现高叶绿素与更绿外观，导致两者表型重叠，模糊SG边界。现有SG研究多聚焦叶级生理生化，叶绿素测定在受控条件准确，但成本高、耗时长、需即时处理，难适于大规模抽样；且目标限于叶，难反映成熟植株整体状态。相比之下，穗作为成熟期功能重要器官，其颜色变化整合叶绿素降解与籽粒发育成熟信息，且田间更易整体观测，但可见光定量潜力未被系统挖掘。颜色指数作为RGB图像信息的简化定量表征，跨作物可有效反映绿度与叶绿素状态，硬件要求低、流程简，但既有研究多止步方法验证或单器官分析，鲜用于系统分辨不同成熟度材料，尤其SG与LM之区分存显著空白。为此，研究人员在标准化简化成像下，系统分析燕麦三成熟类型叶穗可见光颜色表型及其与叶绿素状态关系，通过跨器官比较与多元统计，评估低成本非破坏表型信息分辨SG与LM的适用性，为田间定义SG与筛选材料提供定量证据。该研究发表于《Frontiers in Agronomy》。

主要关键技术方法：研究人员于青海西宁湟中区燕麦育种基地（海拔2592 m，高原大陆气候）采集裸燕麦（Avena sativa L.）品种青燕3号种群内自然分化的三种成熟相关表型各15株，计45株：正常成熟（Normally maturing, NM）、持绿（SG）、晚熟（LM）。取样日为2025年9月15日（青燕3号正常收获期），全株拔取置遮阴户外约6 h模拟田间无法即时处理状态，随后平铺黑天鹅绒布统一背景。成像采用商用智能手机（Apple iPhone 15 Pro）后置主摄，JPEG格式3024×4032像素，室内3000 K暖白LED均照、AE锁定、距叶面约150 cm垂直拍摄，叶选穗下第二叶、穗选中部。颜色指数自Adobe Photoshop 2024提取ROI均值RGB计算ExG（2G?R?B）、GLI（(2G?R?B)/(2G+R+B)）、G/R、Hue（HSV空间H通道）；叶绿素用80%丙酮乙醇1:1浸提6 mm叶圆片，Arnon方程算叶绿素a、b、总叶绿素、类胡萝卜素。统计用R 4.5.2做单因素ANOVA+Tukey HSD、PCA、PLS-DA（VIP）、MLR+VIF、RF分类。

研究结果：3.1 植株形态与叶色目测评估：成熟期NM整体黄枯、穗全黄、旗叶与第二叶失绿；SG穗色同NM但茎叶显绿、第二叶大部绿；LM全株深绿、穗偏绿。目测确认SG定义为穗熟而叶绿之异步成熟。3.2 叶色素与颜色定量：第二叶色素含量LM>SG>NM且组间显著（p<0.05），SG显著高于NM但低于LM，印证叶绿素梯度。3.3 叶颜色指数变异：ExG、GLI、G/R、Hue四项NM显著低于SG/LM，ExG与GLI在NM为负、SG/LM为正；SG与LM四项无显著差异（p>0.05），分布高度相似，说明单凭叶色指数难分SG与LM。3.4 颜色指数多元分析与共线性：PCA前二主成分占98.2%方差，NM沿PC1与LM/SG清晰分离；PLS-DA一致，四指数VIP近/超1.0；MLR中ExG、GLI的VIF达48.586、42.906，G/R与Hue的VIF为5.493、5.211，仅G/R显著，证实ExG/GLI强共线。3.5 叶绿素估算模型：剔除ExG/GLI后以G/R+Hue建MLR，VIF降至1.959，调整R²=0.864，G/R（p=0.005）与Hue（p=0.021）均显著；单变量G/R对叶绿素R²=0.852、RMSE=3.26，Hue R²=0.844、RMSE=3.36；PLS+留一交叉验证Q²_cv=0.977、RMSE_cv=0.758，公式：预测叶绿素=?32.027+38.951×(G/R)+0.187×Hue。3.6 穗色定量与多元分析：穗四指数NM、SG、LM间均显著，ExG与GLI在SG为负/近零（?11.89、?0.017），NM居中，LM最高（43.46、0.062），G/R与Hue同向递进；PCA前二主成分占94.7%方差，SG分布于PC1负区，与NM/LM清晰分；NM与LM虽置信椭圆边缘重叠但整体分布异。3.7 RF分类与特征重要性：以叶+穗四指数建RF，总精度高，SG全对、NM/LM间少量误分、SG与另两组零误分；Mean Decrease Gini显示Hue最重要，次GLI、ExG，G/R最低，证明穗色补入后SG/LM分辨显著提升。

讨论部分总结：研究人员指出RGB颜色指数在成熟燕麦叶能有效刻画绿度滞留，即便样品脱水卷曲仍捕获残叶绿素趋势；G/R与Hue选模在简化流程下延拓了田间向叶绿素相对梯度估算的适用面。但叶色单用不足以分SG与LM——两者叶绿素与叶色指数重叠，因LM绿度源自发育延迟而非衰老延迟，青燕3号兼用粮饲背景下SG价值在穗熟同时保绿产优质饲草，LM则穗不熟，故必须引入成熟态信息。穗色填补此缺口：SG穗黄、LM穗绿，PCA与RF均证穗色将SG自LM解离。讨论亦坦陈局限：模型基于单品种单点单季、无色卡校准、离体后6 h遮阴处理一致但未测穗色素与籽粒含水率，故成熟为农艺收获成熟非严格生理成熟，泛化需多种群多环境验证。

结论部分翻译：本研究证明图像衍生颜色指数提供了稳健且田间相关的手段，用以量化燕麦成熟期绿度与叶绿素相关性状。尽管持绿（SG）与晚熟（LM）类型叶色特征大体重叠，穗基颜色性状提供额外分辨力，揭示成熟类型间更清晰分化。结果表明，成熟期单靠叶绿度不足以区分衰老延迟与发育延迟。通过将可见光颜色分析由叶扩展至穗，燕麦持绿可定义为：成熟燕麦叶仍显绿，而穗表现成熟性状。所提低成本基于图像的框架提升了成熟期表型分辨率，并为燕麦及潜在其他谷类作物持绿性状评价提供实用参照。