《Discover Neuroscience》：Engineering chitosan functionalized extracellular vesicles for targeted brain gene delivery and neurotherapeutics
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基因治疗是现代医学治疗脑部疾病的关键前沿领域；然而，一个重大障碍阻碍了其进展。治疗分子以安全有效的方式递送至脑部存在极大困难。挑战在于血脑屏障（blood brain barrier, BBB）阻断了大多数药物的进入。外泌体（exosomes）由于其先天跨越该
基因治疗是现代医学治疗脑部疾病的关键前沿领域；然而，一个重大障碍阻碍了其进展。治疗分子以安全有效的方式递送至脑部存在极大困难。挑战在于血脑屏障（blood brain barrier, BBB）阻断了大多数药物的进入。外泌体（exosomes）由于其先天跨越该屏障的能力以及生物相容性，为这一问题提供了强有力的解决方案，使其成为基因递送的卓越平台。本文详细分析了工程化这些外泌体的最新方法，特别强调壳聚糖（chitosan）。壳聚糖具有独特的性质，可增强外泌体功能。作者引入了一个清晰的框架来组织与理解这种壳聚糖工程化外泌体系统。该框架基于关键特征对其进行分类，如设计架构、所携带的遗传货物类型、特定靶向机制以及向临床应用发展的阶段。本综述还提供了临床前动物研究的比较分析，以评估这些系统的治疗潜力、局限性及其向人类试验的进展。它进一步涵盖了利用壳聚糖改善外泌体工作流程关键步骤的创新技术。这些步骤包括外泌体的分离与纯化、药物/基因货物的高效装载以及脑组织的精确靶向。来自这些临床前模型的证据表明，经壳聚糖修饰的外泌体相比未修饰版本实现了更优的基因转移效率，并产生更强的神经保护效果。本综述概述了阻碍临床应用道路的当前挑战，包括可扩展制造和长期安全性研究。目标是将基于壳聚糖的外泌体基因治疗从一个有前景的概念推进为针对一系列神经系统疾病的可行且标准化的治疗方法。
1 引言
外泌体工程是一个不断发展的学科，核心在于改变细胞释放的微小囊泡——外泌体，以增强其在基因治疗中的治疗能力。外泌体具有独特的品质，使其成为核酸（如小干扰RNA（siRNA）和微RNA（miRNA））的理想载体。这是因为外泌体能够跨越生物屏障并进入其他递送技术无法到达的组织区域。然而，外泌体有限的靶向能力给其临床应用带来了障碍。科学家已研究多种方法来改善外泌体的组织靶向能力以克服这一限制。研究展示了一种值得注意的方法，即利用表面功能化技术修饰外泌体以治疗脑缺血。在该研究中，研究人员使用负载姜黄素的外泌体，并将其与一种已知对脑内特定受体具有亲和力的肽c(RGDyK)偶联。表面修饰使工程化外泌体在静脉注射后能够靶向脑缺血受损区域。小鼠模型研究结果表明，修饰后的外泌体穿越了具有挑战性的BBB并到达缺血脑的受损区域。这一进展展示了修饰外泌体以解决脑部递送难题的能力，并为治疗脑缺血开辟了新途径。基于壳聚糖的支架因其显著的生物相容性、生物可降解性及形成水凝胶的能力，为外泌体递送提供了重要优势。这些特性增强了外泌体的持续释放，同时减轻了它们的快速降解。研究表明，N-琥珀酰壳聚糖氧化透明质酸基水凝胶表现出良好的性能，如高溶胀率和降解率、强粘附性和自愈合能力。此外，该水凝胶促进了骨髓干细胞（BMSCs）的成骨分化，并刺激了人脐静脉内皮细胞的血管生成。图1综合了神经治疗中对外泌体进行壳聚糖工程的三个关键方面。首先，它描述了两种主要的修饰方法：直接表面偶联和基因工程，这些方法使外泌体适用于精确靶向和增强的递送效率。其次，它概括了壳聚糖基生物材料作为递送平台和再生支架的广泛应用，这些应用补充了基于外泌体的治疗。最后，它可视化了外泌体介导的治疗货物细胞间运输的动态过程，这是外泌体作为天然载体和信号实体在基因治疗及神经再生医学中发挥作用的基础。
最近的研究取得了显著突破，创造了一种使用工程化外泌体治疗骨关节炎的先进方法。外泌体装载了特定的microRNA（miR-140），该分子在减缓骨关节炎进展方面显示出潜力。为了提高靶向精度，研究人员在外泌体表面整合了软骨细胞亲和肽。关节内注射后，标记的外泌体表现出显著的能力，能够渗透致密的细胞外基质（ECM）并到达软骨的最内层区域。这一能力至关重要，因为骨关节炎会影响这些难以到达的区域。该研究展示了修饰后外泌体在阻止骨关节炎进展方面的功效，为这种普遍的关节疾病提供了一种有前景的替代治疗。研究结果表明，外泌体工程对推进靶向基因治疗具有重大影响。通过修饰外泌体表面，研究人员可以增强其组织特异性靶向能力，从而将治疗货物递送至期望的作用部位。这些进展影响着精准医学的未来，因为外泌体作为非侵入性无细胞治疗载体具有巨大潜力。预计进一步的调查和发展将揭示更广泛的应用。研究人员正在探索各种方法，如靶向配体抗体、肽和其他表面修饰，以提高外泌体介导递送的精确性和有效性。此外，正在努力开发改进的制造技术并增强可扩展性，以实现工程化外泌体的大规模生产用于广泛的临床应用。外泌体工程在基因治疗领域前景广阔，因为它有潜力克服传统递送方法的局限性。随着研究的推进和新发现的出现，外泌体将在推进针对各种疾病和病症的靶向和个性化治疗中发挥关键影响。图2展示了以工程化外泌体为核心的多组分治疗平台，用于靶向基因递送和组织再生。核心策略涉及通过细胞内装载治疗性mRNA和表面偶联靶向部分对外泌体进行双重功能化，以增强细胞特异性和摄取。为了实现持续释放和局部作用，这些修饰的外泌体被嵌入生物相容性水凝胶支架（GelMA）中。所证明的结果包括成功内化、强大的靶基因和蛋白质表达以及有效的细胞分化诱导，验证了这种方法作为先进靶向基因治疗的强大方法。表1显示了用于基因和药物递送的EV货物装载策略的比较概述，重点介绍了它们的装载效率、货物兼容性、EV完整性和关键优势与局限性。
外泌体可以携带不同类型的治疗货物，如核酸（siRNA、miRNA和mRNA）、蛋白质、小分子甚至CRISPR Cas9基因编辑工具。该技术的灵活性实现了多种治疗应用，如基因抑制、基因活性调节以及蛋白质替代和药物的精确给药。外泌体工程的主要目标是改善外泌体的靶向能力。为了实现这一目标，可以改变外泌体的外部，附着靶向配体（如抗体、肽和适配体），这些配体可以识别并结合所需细胞和组织上的受体。通过整合这些靶向分子，修饰的外泌体可以将其有效载荷运输到特定的细胞类型，减少非预期影响并最大化治疗效果。壳聚糖可以通过多种给药途径递送，其降解速率取决于聚合物的分子量和脱乙酰化程度。纳米颗粒的特性（包括大小和电荷）影响其药代动力学特征和在体内的分布。Wen等人的研究表明，经壳聚糖修饰的外泌体代表了一种简单自然的纳米级药物递送平台。这些外泌体能有效引导化疗药物到达肿瘤，从而最大限度地减少与这些治疗相关的毒性和副作用。预计其他类型的化疗药物也可以使用壳聚糖修饰的外泌体递送至肿瘤组织。壳聚糖材料的成功改性为连接其他带电实体（如酸性环境中的带电RNA物质、牛磺酸、叶酸和多肽蛋白等）创造了机会。利用肿瘤细胞产生的外泌体的高产率和低毒性，并对其进行壳聚糖进一步修饰以增强药物递送，为临床应用提供了可观的机会。然而，该研究存在重大局限性，包括未检查肿瘤外泌体相关癌基因的表达。需要进一步的研究和验证，以了解肿瘤外泌体中致癌片段促进肿瘤转移的潜力。此外，肿瘤外泌体对免疫激活的影响及其在影响肿瘤微环境中的潜在作用需要更深入的探索和验证。表2总结了近期在不同场景下对壳聚糖修饰外泌体的研究，展示了主要发现、研究目标、研究局限性和未来发展方向。
外泌体具有跨越生物屏障（包括BBB）的固有能力。这一独特属性使其对向中枢神经系统（CNS）施用治疗物质和神经疾病管理具有吸引力。通过外泌体工程，科学家可以增强外泌体克服这些障碍的能力，从而扩大对难以到达区域进行精确药物递送的潜力。来自特定细胞类型（如树突状细胞）的外泌体具有内在的免疫调节特性。通过操纵外泌体，可以利用其免疫调节特性进行治疗应用，例如掺入特定的免疫调节分子。这种方法在癌症免疫治疗等领域显示出潜力，其中修饰的外泌体可以激活和抑制免疫反应，以提高抗肿瘤效果。
外泌体是诊断和预后生物标志物的宝贵来源，因为它们携带了关于其特定细胞来源的多样化信息，包括蛋白质、核酸和脂质。因此，它们对于疾病识别和预测很有价值。通过检查外泌体货物，科学家可以了解与特定疾病相关的分子特征，从而开发非侵入性诊断测试和量身定制的治疗方法。外泌体具有再生特性，可以促进组织修复和再生，使其在再生医学中很有价值。定制的外泌体可以运输特定的生长因子、细胞因子和其他再生物质，增强其在再生医学中的治疗效果。这些修饰的外泌体可以增强组织修复、诱导干细胞特化并调节周围微环境以促进组织再生。外泌体工程使得组合疗法成为可能，包括将多种治疗剂和模式结合在单个外泌体或工程化外泌体的混合物中。这种方法允许多种治疗有效载荷的联合作用，通过靶向递送改善治疗效果。蒽环类药物作为抗肿瘤抗生素，与显著的心脏毒性有关，限制了其在临床环境中的使用。外泌体在细胞间通讯中至关重要，并以其优异的生物相容性和对特定组织和器官的靶向能力而闻名。本研究以多柔比星（DOX）这一常用的蒽环类化疗药物为主要研究对象。采用肿瘤来源的外泌体作为递送系统，以减轻与DOX相关的显著心脏毒性。自体外泌体表现出强大的归巢能力，增加了肿瘤细胞中的药物吸收，同时降低了心脏毒性。这些外泌体的表面用壳聚糖修饰，以增强其稳定性、提高治疗效果并最大限度地减少毒副作用。壳聚糖还具有独特的抗肿瘤作用，通过靶向肿瘤干细胞上的CD44受体，通过电荷吸附机制促进与肿瘤细胞的相互作用。通过体内药代动力学评估以及原位异位裸鼠肿瘤模型，研究结果表明，壳聚糖修饰的肿瘤外泌体减少了与DOX相关的严重心脏毒性，同时显示出显著的抗肿瘤功效。本研究提出了一种减轻蒽环类化疗药物不良反应的创新方法，采用了一种有前景的纳米载体递送系统。壳聚糖是唯一的带正电荷的天然多糖。由于其低毒性和生物相容性，该材料具有多种化学应用，包括-NH2基团和不同的分子量。化学修饰的简单性是壳聚糖的一个显著优势，可以对其进行精炼以产生适合治疗用途的生物材料。观察表明，肝脏是静脉注射后壳聚糖吸收的主要器官。肝脏中的浓度已被证明随着分子量的增加而增加。此外，对负载姜黄素的壳聚糖修饰脂质体的研究表明，该修饰改善了粘膜粘附性、储存稳定性和包封效率。壳聚糖涂层提供了诸如稳定物理化学性质、允许药物控释、增强组织和细胞相互作用以及提高药物疗效等优势。研究表明，负载DOX的外泌体比现有制剂（如Doxil?）更有效，突显了脂质体制剂在抑制肿瘤生长方面的局限性。尽管外泌体因其独特的磷脂双层结构和改善的生物相容性而被认可，但将其用于壳聚糖修饰和药物递送的当前文献尚未被研究。重要因素包括其制备、表征、细胞毒性、摄取以及体内和体外研究。本研究旨在提取肝细胞癌（HCC）相关HepG2细胞系释放的外泌体，并用壳聚糖修饰这些外泌体。自体外泌体和壳聚糖可以协同作用，通过多种机制产生抗肿瘤作用，包括抑制肿瘤转移、增强肿瘤蓄积、促进肿瘤渗透、增强肿瘤免疫力和提高药物的抗肿瘤功效。这种协作可能利用自体外泌体的天然特性，提高其靶向肿瘤的效果。将多柔比星（DOX）掺入壳聚糖修饰的自体外泌体（CS EXO@DOX）中。研究人员通过表征、细胞毒性测试和细胞摄取分析评估了CS EXO@DOX的有效性和安全性。此外，还进行了细胞凋亡评估、体内药代动力学研究、成像以及小鼠的组织分布评估。该研究还包括体内抗肿瘤研究以及肿瘤的TUNEL荧光凋亡分析。这项工作似乎是首次使用壳聚糖修饰肿瘤外泌体，将DOX递送至裸鼠实体瘤。结果表明，壳聚糖修饰的载DOX外泌体是一种安全有效的药物递送系统。外泌体工程领域正朝着临床应用方向发展。多项正在进行的临床试验评估了基于外泌体的治疗对各种疾病（如癌症、神经系统疾病和心血管疾病）的安全性和有效性。这些试验旨在确定工程化外泌体作为安全有效治疗干预措施的可行性。转染是一种用于修饰外泌体的灵活技术，其中操纵供体细胞以产生含有治疗基因的外泌体。表3显示了用于CNS靶向和神经治疗递送的代表性工程化细胞外囊泡平台，重点介绍了它们的工程策略、治疗货物、靶向机制以及报告的治疗效果。
转染在供体细胞中引入外源遗传物质（如治疗基因）。供体细胞的选择基于其分泌外泌体的能力，外泌体是由细胞释放的膜包裹的小囊泡。随后，这些外泌体可以被收集并用作将治疗物质运输到特定细胞和组织的载体。转染的一种应用可以通过壳聚糖实现，壳聚糖可用作外泌体的涂层。转染以其将遗传物质递送至细胞的高超效率而闻名。根据所选的转染技术和供体细胞的属性，不同研究中记录的转染率高达90%。这一过程的显著效率保证了大部分供体细胞整合了治疗基因，从而更出色地产生含有所需货物的工程化外泌体。转染提供了特异性的优势，因为它可以靶向特定的细胞和组织。通过选择合适的供体细胞并使用精确的转染技术，可以生成将治疗基因运输到预期靶细胞和组织的外泌体。在尝试靶向使用替代递送方法难以到达的细胞时，这种特异性水平是有利的。例如，在管理神经系统疾病时，可以采用转染来创建能够跨越BBB并向脑细胞递送治疗基因的外泌体。通过转染产生的外泌体表现出优异的强度，使得能够长期储存而不降解其治疗特性。外泌体的稳定性对于推进和生产基于外泌体的治疗至关重要，因为它允许为未来应用高效制造大量工程化外泌体。在合适的条件下，外泌体可以稳定储存，保持其货物的完整性和功能，直到准备施用。由于其劳动密集型和耗时性，转染过程阻碍了其扩大规模以用于工程化外泌体的大规模生产。该过程涉及培养许多供体细胞、制备转染复合物以及微调条件以实现最佳基因递送效率。这些程序需要细致的操作，在扩大到满足临床和商业应用需求时可能带来困难。为了克服这一限制，研究人员正在研究提供增强工程化外泌体制造可扩展性的替代方法和技术。转染过程的结果可能表现出变异性。转染率可能因多种因素而异，包括细胞类型、使用的转染方法和转染试剂的有效性。这些变量会造成差异，并使获得一致和可重复的结果变得复杂。因此，有必要针对每种特定用例优化和验证转染程序，以保证可靠和可预测的结果。转染可能对提供遗传物质的细胞造成有害影响。以高转染效率将外源遗传物质引入细胞可能会干扰细胞过程并引发细胞应激反应。细胞毒性作用可能因细胞类型、转染方法和所用转染试剂浓度等变量而异。在通过转染进行外泌体工程时，确保高转染率和最小细胞损伤是一个关键因素。研究人员正在研究新的方法和途径，以减小对细胞的有害影响并提高修饰外泌体的安全性。图3说明了用于持续递送治疗性外泌体的壳聚糖支架的设计和体内验证。该生物材料平台是通过将MSC衍生的外泌体装载到热稳定的壳聚糖基质上而制造的。其治疗机制涉及局部释放外泌体，调节宿主环境以增强血管生成、促进抗炎并刺激复杂的组织再生。体内实验证实，壳聚糖-外泌体复合材料加速了愈合，这通过改善的伤口闭合率和新生血管形成及胶原沉积的组织学标志物得到证明，这确立了其作为外泌体治疗的强效生物材料递送系统。
2 外泌体介导的脑部疾病基因治疗
基于外泌体的基因治疗作为一种治疗策略，对一系列脑部疾病（如神经退行性疾病、脑肿瘤、中风和创伤性脑损伤（TBI））显示出相当大的前景。神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病）由于大脑的复杂结构和治疗药物的有限可用性，对治疗构成了重大挑战。外泌体通过充当先天纳米载体提供了一种有希望的解决方案，可以将治疗基因运输到大脑中的靶细胞。外泌体介导的基因治疗在神经退行性疾病领域提供了许多优势。一个显著的好处是外泌体能够规避BBB。这一具有选择性的屏障限制了大多数物质从血液进入大脑。外泌体可以被修饰以运输治疗基因并穿越BBB，从而能够精确递送至特定脑区。外泌体可以通过向神经元递送治疗基因来阻碍和减缓神经退行性疾病的进展，从而促进神经元存活、减少炎症并增强细胞修复机制。多项研究表明，外泌体介导的基因治疗在神经退行性疾病的临床前模型中有效。在帕金森病小鼠模型中，发现含有脑源性神经营养因子（BDNF）基因（促进神经元存活和功能）的外泌体可增强运动功能并保护多巴胺能神经元免于变性。这项研究强调了外泌体运输能够恢复和增强神经退行性疾病中神经元功能的治疗基因的能力。另一项关于帕金森病的研究检查了含有α-突触核蛋白（α-synuclein）基因的外泌体的利用。研究表明，修饰的外泌体减少了帕金森病小鼠大脑中α-突触核蛋白的积累，这表明了一种有前景的阻止疾病进展的治疗方法。尽管这些研究展示了外泌体用于基因治疗的潜力，但仍需要额外的研究来优化递送技术、增强靶向精度并保证持续的治疗效果。挑战包括提高基因装载到外泌体中的效率、增强外泌体在大脑环境中的稳定性，以及设计靶向复杂神经网络中特定细胞类型的策略。此外，必须全面研究外泌体介导的基因治疗的安全性和潜在不良反应。在引入基因时，必须谨慎行事以防止意外后果和引发免疫反应。当前研究正在探索提高外泌体介导的基因治疗安全性的方法。这包括利用特定的启动子和调控元件来控制基因表达，以及整合遗传安全开关来防止非预期效应。
