成像质谱流式技术在泡型棘球蚴病免疫微环境中的应用

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：The application of imaging mass cytometry in the immune microenvironment of alveolar echinococcosis

　　

背景：肝泡型棘球蚴病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）是由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）幼虫感染引起的慢性寄生虫病，以肝脏侵袭性病灶形成为特征，伴随免疫系统细胞增殖反应。尽管手术切除是首选治疗，但晚期患者常丧失手术机会且药物治疗疗效有限。免疫微环境在疾病进展中起关键作用，但其在HAE中的空间异质性尚未被系统阐明。方法：研究人员获取3例HAE患者病灶邻近组织及配对远端肝组织，采用含28个免疫标志物的抗体面板进行成像质谱流式（imaging mass cytometry，IMC）分析，应用PhenoGraph聚类和t-SNE降维对单细胞数据分类可视化，并分析细胞间空间互作。结果：病灶邻近与远端肝组织均呈现显著免疫细胞浸润及明显空间异质性。病灶邻近组织以活化CD8+ T细胞（Cluster 3/19）和CD56+ NK细胞（Cluster 17/18）为主，呈免疫活化状态并形成三级淋巴样结构（tertiary lymphoid structure，TLS）样结构；B细胞（Cluster 1）在邻近区减少，巨噬细胞（Cluster 6）与B细胞显著共定位，提示巨噬细胞可能通过抗原提呈等过程调控B细胞功能。结论：本研究利用IMC技术揭示HAE免疫微环境的复杂图谱与异质性，为开发免疫治疗策略提供新靶点与见解。

研究背景与立项依据

肝泡型棘球蚴病（HAE）由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）幼虫感染所致，具侵袭性生长与转移特征，未治疗10年病死率超90%。现有手术与苯并咪唑类药物因病灶弥漫及纤维化屏障疗效受限。既往研究虽提示中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及Th1/Th2失衡、调节性T细胞（Tregs）异常活化、髓源性抑制细胞（MDSCs）浸润构成抑制性免疫微环境促进寄生虫免疫逃逸，但传统流式细胞术丢失原位空间信息、免疫组化（≤5标记）难捕表型异质性，致使HAE免疫微环境空间异质性及其与寄生虫免疫逃逸关联不清。成像质谱流式（IMC）以金属同位素偶联抗体实现组织内≥40标记高通量检测并保留单细胞空间定位，已在肿瘤免疫微环境显优势，但在寄生虫病领域尚处起步。研究人员据此构建HAE肝组织免疫细胞图谱，系统表征其免疫微环境景观。

主要技术方法概述

研究人员纳入青海大学附属医院伦理审批的3例HAE患者（女33岁、男25岁、女45岁，含长期阿苯达唑治疗史1例），取病灶邻近与距灶缘≥2 cm远端肝组织蜡块切片。经热诱导表位修复后，以28抗体面板（覆盖淋巴细胞、髓系、肝星状细胞、增殖、活化及PD-1/CD274/CD273等免疫治疗相关分子）行Hyperion系统200 Hz光栅扫描获IMC原始数据；CellProfiler基于Ir¹⁹¹/Ir¹⁹³核染及膜标记分割单细胞，Harmony校正批次效应，Z-score标准化；PhenoGraph（Louvain）聚类、Barnes-Hut t-SNE降维；R语言imcRtools做空间互作置换检验（1000次），非参数Wilcoxon符号秩检验比较近远灶细胞密度。

研究结果

3.1 病灶与周围组织免疫微环境景观

3.1.1 T淋巴细胞亚群功能异质性

CD3⁺ T细胞为浸润主力且空间异质。近端CD8⁺ T细胞以CD45RO⁺记忆表型为主但呈静息（HLA-DR^-、IFN-γ^-、PD-1^-，无PD-L1/PD-L2共定位）；远端CD8⁺ T细胞呈活化（HLA-DR⁺、IFN-γ⁺、PD-1⁺）。近端CD4⁺ T细胞效应当样（CD45RA⁺、TNF-α⁺、IFN-γ⁺、PD-1⁺）但T-bet/GATA-3/Foxp3/Bcl-6低表达，属未完全分化早期辅助T细胞。

3.1.2 调节性T细胞与Th亚群互作

病灶内Foxp3⁺ Tregs高表达TGF-β呈功能活化，与Th1细胞空间排斥；微环境并存Th2（GATA-3⁺）、Tfh（Bcl-6⁺）、Th17（IL-17⁺）异质亚群。

3.1.3 固有免疫细胞活化特征

近灶CD56⁺ NK/NKT细胞呈高度活化（HLA-DR⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺IL-6⁺）；髓系单核/巨噬细胞HLA-DR、TNF-α、IFN-γ上调示抗原提呈与促炎增强；近端B细胞（CD19⁺）密度显著低于远端。

3.1.4 免疫微环境动态特征

近远端均见Ki-67⁺ Tfh增殖；α-SMA染色示致密血管网为持续免疫浸润提供架构。

3.2 HAE免疫微环境异质性分析

3.2.1 差异蛋白表达谱

近端相较远端免疫标记总体升高，特异富集IFN-γ⁺、IL-6⁺、PD-L1⁺、CD33⁺群体（示活化与PD-L1/CD33介导抑制并存），CD15⁺、CD8a⁺、IL-17a⁺普遍升高但未成新亚群。

3.2.2 细胞聚类分析

UMAP/t-SNE结合PhenoGraph获19簇。近端特异富集Cluster 17/18（高PD-1，Cluster 17低CD56示NK活化）及Cluster 3/19（高PD-1/CD8/IFN-γ/IL-6，活化CD8⁺ T）；近端亦见Cluster 9/10/11比例偏高（Cluster 11高IL-17α）。远端富集Cluster 1（CD19⁺ B细胞）、Cluster 16（GATA-3⁺ Th2）及Cluster 8/13/15（高Ki-67非免疫增殖细胞）、Cluster 2/5/7。

3.3 空间互作网络特征

3.3.1 细胞分布属性

Cluster 14/19弱空间自相关呈弥散；Cluster 1（B细胞）与Cluster 7（巨噬细胞）强共定位高共表达CD3/CD19/CD68；Cluster 9（CD4⁺ T）为多簇互作中枢。

3.3.2 区域特异互作差异

近端Cluster 1（B细胞）与Cluster 6（活化巨噬）显著共定位，Cluster 9（Tfh）与Cluster 1互作增强，支撑TLS内抗体产生；远端Cluster 2（Th17）与Cluster 5（中性粒）互作驱动IL-17α炎症级联促纤维化。

讨论部分总结

研究人员指出CD8⁺ T细胞近灶静息/远灶活化之空间二分反映抗原暴露梯度与基质因子分区调控，近端PD-1⁺耗竭CD8⁺ T（Cluster 3/19）为慢性HAE T细胞耗竭模型提供空间验证；近端CD56⁺ NK（HLA-DR⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺）与功能沉默CD8⁺ T共定位揭示“空间免疫区室化”妥协机制——NK守防线而CD8⁺ T代谢静息防过度损伤，类同慢性病毒感染“分裂耐受”。CD4⁺ T分化停滞（T-bet^low/GATA-3^low）伴Treg过度活化建立寄生虫免疫特权。近灶免疫标记升高伴代偿性PD-L1/CD33抑制示“活化-抑制”失衡；近灶活化CD8⁺ T/NK、远灶B/Th2之区室分布对应细胞免疫清除与体液/调节稳态之需。CD4⁺ T为互作枢纽；近灶巨噬（Cluster 6）-B细胞（Cluster 1）共定位提示抗原提呈或局部清除/抑制B增殖以维持外周耐受；远灶Th17-中性粒互作镜像蠕虫纤维化炎症级联。研究人员坦言样本仅3例配对、缺病程分期、患者1长期阿苯达唑具免疫调节混杂、缺血清细胞因子匹配系假设生成性结论，需多中心大队列验证。

结论翻译

本研究运用IMC描绘HAE免疫微环境复杂景观与深刻空间异质性。病灶邻近与远端组织均见显著免疫细胞浸润及明显空间异质性。近端病灶B细胞丰度降低且B细胞-巨噬细胞显著共定位，提示巨噬细胞经抗原提呈及相关机制参与B细胞功能调控。同时近端细胞增殖明显受抑。这些发现深化了对HAE免疫发病机制——尤其微环境异质性与细胞互作网络——的机制理解，为开发该病免疫治疗策略提供新颖潜在靶点及概念框架。论文发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。