Panellus edulis 子实体发育相关基因的全基因组与转录组整合分析

《Frontiers in Ecology and Evolution》：Integrated genomic and transcriptomic analysis of genes involved in fruiting body development of Panellus edulis

　　

引言：Panellus edulis是一种广泛分布于中国东北地区的可食用且具有药用价值的担子菌，因其优良的食用品质和生物活性而备受青睐。为深入理解P. edulis子实体发育的分子机制，研究人员开展了全基因组和转录组测序。方法：研究人员整合Illumina NovaSeq短读长测序与PacBio Revio长读长测序，为单核菌株SE6-23生成了高质量的参考基因组。以此参考基因组为基础，在Illumina NovaSeq 6000平台上对SE6菌株三个发育阶段（原基（SE6-P）、子实体分化（SE6-F）和成熟子实体（SE6-M））进行了阶段特异性RNA-seq。对不同发育阶段的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，并使用qRT-PCR验证测序结果。结果：组装的基因组大小为35.21 Mb，GC含量为48.10%，包含10,490个预测的蛋白质编码基因。获得了57.14 Gb的转录组数据，将其比对到参考基因组后鉴定出2,966个新基因。差异基因表达分析在SE6-P vs SE6-F、SE6-F vs SE6-M和SE6-P vs SE6-M中分别鉴定出360、652和1,057个注释的差异表达基因（DEGs）。值得注意的是，编码苯丙氨酸解氨酶、糖苷水解酶家族和醛酮还原酶家族的基因持续上调，在生长和发育过程中发挥重要的调控作用。KEGG通路注释进一步将编码PAL的基因归属到苯丙氨酸代谢通路（ko00360），支持PAL介导的L-苯丙氨酸转化为下游苯丙素类相关中间体可能与发育进程相关的观点。qRT-PCR验证了RNA-Seq分析的准确性。讨论：总体而言，本研究为P. edulis提供了改进的基因组组装和注释，扩展了关键发育阶段的转录组资源，并为该物种的基因定位、功能表征和分子育种工作奠定了坚实的基因组基础。

论文解读：Panellus edulis 子实体发育相关基因的全基因组与转录组整合分析

一、研究背景与目的

食用菌不仅因其独特的风味被广泛消费，还因其优越的营养特性（如高质量蛋白质、低脂含量和低能量密度）而受到重视。近年来，食用菌研究已从传统的驯化、栽培和生理特性描述，扩展到分子育种、遗传工程、形态发生机制以及环境感知和胁迫响应通路等领域。其中，子实体发育是决定栽培食用菌产量和商品品质的关键因素。因此，解析子实体生长发育背后的基因、调控网络和代谢通路已成为真菌生物学和食用菌生物技术的核心焦点。目前，已在多种食用菌中鉴定到与子实体生长和发育相关的基因，例如灵芝（Ganoderma lucidum）、竹荪（Dictyophora indusiata）、白灵菇（Pleurotus nebrodensis）、香菇（Lentinula edodes）、羊肚菌（Morchella importuna）和白玉菇（Hypsizygus marmoreus）等。在糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）中，已鉴定出多个参与子实体发育的功能基因，包括编码乙醛脱氢酶、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶、转录因子和NADPH氧化酶的基因。此外，AMP依赖性信号在蘑菇发育中的调控作用也已有报道。在双孢蘑菇（Agaricus bisporus）中，已鉴定到编码疏水蛋白、脲酶、甘露醇脱氢酶、转录因子和GTP结合蛋白的基因。热休克蛋白、小分泌蛋白、激酶、F-Box蛋白以及与细胞壁重塑相关的基因也被报道参与其他担子菌的子实体发育。目前，栽培食用菌的种类已从十几种增加到近百种，同种食用菌也因颜色、形态、生长周期等差异形成独特品种。探索不同类型食用菌的生长发育相关基因和代谢通路，不仅能丰富和细化现有的食用菌组学数据，也为解析食用菌生长发育机制提供数据支持。

P. edulis因其独特口感深受消费者喜爱，已在驯化栽培、活性成分、优良菌株筛选和遗传机制等方面开展了研究。该团队长期从事P. edulis的遗传育种和栽培研究，收集并评价种质资源，分析核心种质的生物学特性，优化SRAP-PCR反应体系，并获得黄褐色菌株的转录组数据。本研究首次获得全基因组数据，并以其为参考基因组，获得该菌株三个生长发育阶段的转录组序列。通过完善基因组注释，可以更准确地筛选不同生长发育阶段的差异表达基因（DEGs），从而更精确地鉴定可能参与P. edulis生长发育的基因和代谢通路。最终，这些基因和通路的探索不仅丰富了可用的多组学数据，也为阐明P. edulis的发育机制、环境胁迫响应和色素形成提供了坚实的理论支持。

二、主要技术方法

研究人员收集了来自中国吉林省白山市的P. edulis菌株SE6，通过组织分离获得纯菌株并保存于吉林农业科技学院。采用单孢分离法从成熟子实体中分离出单核菌株SE6-23，用于从头基因组测序。将菌株SE6接种于木屑培养基（木屑78%，麦麸20%，石灰1%，石膏1%，pH 6.0），每袋干料250 g，培养温度15°C，湿度90%，自然光照。在原基期（出菇第5天）、子实体分化期（出菇第10天）和成熟子实体期（出菇第15天）三个不同发育阶段采集样本，每个阶段设三个生物学重复。

基因组测序采用PacBio Revio长读长测序平台和Illumina NovaSeq 6000短读长测序平台，测序深度154.0×。使用Unicycler和Flye软件进行组装，Pilon软件基于二代高质量数据进行校正。基因功能注释通过Augustus、GlimmerHMM和GeneMark ES进行从头预测，tRNAscan-SE、RNAmmer和Rfam进行非编码RNA预测，RepeatModeler和RepeatMasker进行重复序列分析，BUSCO评估基因组完整性。功能注释通过BLAST比对NR、GO、KEGG、COG、SwissProt和PHI等数据库完成，并使用dbCAN2搜索CAZymes数据库。转录组测序对三个发育阶段的9个样本（SE6-P、SE6-F、SE6-M，各三个生物学重复）提取总RNA，构建cDNA文库后在NovaSeq 6000平台测序。以SE6-23基因组为参考，使用HISAT2比对，StringTie组装和定量，表达量标准化为FPKM。使用DESeq2进行差异表达分析，筛选标准为|log2(fold change)| ≥ 0.585（即|fold change| ≥ 1.5）且FDR < 0.01。最后进行GO和KEGG富集分析，并用qRT-PCR验证RNA-seq结果的准确性。

三、研究结果

1. SE6-23的基因组特征

对SE6-23进行基因组测序，Illumina测序产生约7.57 Gb数据，平均测序深度180×，Q30平均值为97.27%。K-mer分析估计基因组大小约为41.73 Mb。PacBio测序产生13.67 Gb长读长数据。最终基因组大小为35.21 Mb，由28个scaffold组成，GC含量为48.10%，N50长度为3.27 Mb。使用circos软件绘制了P. edulis基因组圈图，展示了GC skew、GC含量、CAZyme、DFVF和KOG等基因组特征的分布。

2. SE6-23基因功能注释

共预测到10,490个蛋白质编码基因，平均基因长度1,859.2 bp。鉴定出69,726个CDS、69,726个外显子和59,236个内含子。BUSCO分析显示98.20%的单拷贝直系同源基因完整。检测到156个tRNA基因、36个rRNA基因和88个非编码RNA。KOG注释中有411个基因与次级代谢物的生物合成、运输和分解代谢相关。KEGG注释将3,420个基因映射到406条通路，主要涉及碳水化合物代谢、信号转导、运输和分解代谢、细胞生长和死亡。GO注释将5,826个基因注释到4,880个GO条目，涵盖分子功能、细胞组分和生物学过程三大类。CAZymes分析显示，糖苷水解酶（GH）基因数量显著高于其他类别，其中GH5家族有21个基因，GH16家族有24个基因。辅助活性（AA）家族中AA3亚家族有29个基因，碳水化合物酯酶（CE）家族中CE10有44个基因。在SE6-23基因组中鉴定出32个次级代谢物基因簇，包括3个萜烯、2个NRPS-like和1个真菌RiPP-like。

3. 转录组组装分析

获得9个样本的转录组测序数据，主成分分析（PCA）显示样本重复性好，不同发育阶段组间差异显著，同一发育阶段样本聚类明显。共获得57.14 Gb Clean Data，每个样本Clean Data达6.05 Gb，Q30碱基百分比在95.19%以上。Clean Reads与SE6-23参考基因组的比对效率在86.98%至88.93%之间。基于比对结果发现2,966个新基因，其中980个获得功能注释。

4. 不同生长发育阶段DEGs分析

SE6-P vs SE6-F共发现360个DEGs，其中208个上调，152个下调。SE6-F vs SE6-M共发现652个DEGs，其中386个上调，266个下调。SE6-P vs SE6-M共发现1,057个DEGs，其中638个上调，419个下调。韦恩图显示三个发育阶段共有54个基因，105个基因仅在SE6-P vs SE6-F阶段出现，333个基因仅在SE6-F vs SE6-M阶段出现，551个基因仅在SE6-P vs SE6-M阶段出现。

5. DEGs的GO功能注释

GO功能注释显示，在SE6-P vs SE6-F阶段，210个DEGs被注释，富集的生物学过程包括细胞分裂、MAPK级联生长调控、蛋白磷酸化信号转导、细胞周期转换调控等。在SE6-F vs SE6-M阶段，404个DEGs被注释，富集的生物学过程包括葡聚糖生物合成、β-葡聚糖生物合成、多糖生物合成等。在SE6-P vs SE6-M阶段，615个DEGs被注释，富集的生物学过程包括甾醇生物合成、谷氨酸代谢、草酸代谢、细胞周期转换调控等。

6. 不同发育阶段DEGs的KEGG功能注释

KEGG富集分析显示，SE6-P vs SE6-F阶段最显著富集的通路包括苯丙氨酸代谢（ko00360）、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（ko00400）、谷胱甘肽代谢（ko00480）等。SE6-F vs SE6-M阶段最显著富集的通路包括核糖体（ko03010）、酪氨酸代谢（ko00350）、内质网蛋白质加工（ko04141）等。SE6-P vs SE6-M阶段最显著富集的通路包括酮体的合成和降解（ko00072）、丁酸酯代谢（ko00650）、类固醇生物合成（ko00100）等。三个发育阶段共富集到38条通路，其中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（ko00260）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、碳代谢（ko01200）、氨基酸生物合成（ko01230）、真核生物核糖体生物发生（ko03008）、RNA转运（ko03013）、核糖体（ko03010）和MAPK信号通路-酵母（ko04011）八条通路富集了大量与氨基酸合成和代谢相关的基因。

7. 苯丙氨酸代谢

KEGG富集分析显示苯丙氨酸代谢通路（ko00360）在三个生长阶段均被富集。在SE6-P vs SE6-F阶段，一个基因（scaffold5.g631）上调，主要编码苯丙氨酸解氨酶。在SE6-F vs SE6-M阶段，三个基因（NewGene_1657、NewGene_1658、scaffold3.g1032）上调，两个基因（scaffold2.g824、scaffold3.g527）下调，分别编码铜胺氧化酶、氨基转移酶和巨噬细胞迁移抑制因子。在SE6-P vs SE6-M阶段，三个基因（scaffold2.g490、scaffold6.g484、scaffold6.g485）全部上调，编码酰胺酶和苯丙氨酸解氨酶。研究表明，苯丙氨酸解氨酶与苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶协同作用，将L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。编码苯丙氨酸解氨酶的基因在不同发育阶段表现出差异表达，提示其可能参与P. edulis的发育转换。

8. qRT-PCR验证DEGs

为验证转录组数据，筛选了6个高表达基因进行qRT-PCR。qRT-PCR结果与RNA-Seq结果一致，证明RNA-Seq数据可靠。其中scaffold5.g976和scaffold5.g961基因仅在SE6-P vs SE6-F阶段出现并显著下调，主要编码蓖麻毒蛋白B样凝集素。scaffold5.g631和scaffold6.g485基因在生长发育阶段显著上调，主要编码苯丙氨酸解氨酶，均可注释到苯丙氨酸代谢（ko00360）通路。

9. 可能对P. edulis生长发育至关重要的基因和蛋白质

在SE6-P vs SE6-F阶段，编码苯丙氨酸解氨酶2的基因上调，而编码蓖麻毒蛋白B样凝集素的基因显著下调。在SE6-F vs SE6-M阶段，编码糖苷水解酶家族和醛酮还原酶家族的基因在子实体形成阶段上调。在SE6-P vs SE6-M阶段，编码糖苷水解酶家族和苯丙氨酸解氨酶的基因上调。

四、讨论与结论

讨论部分指出，对于尚无高质量基因组序列的食用菌，从头转录组测序是合适的选择。而对于已有高质量基因组的物种，有参考基因组指导的转录组测序能更准确地定量基因表达并识别等位基因特异性表达。本研究将P. edulis SE6菌株的转录组数据同时进行有参考组装和从头组装，发现从头组装得到的DEGs数量显著低于有参考组装，且GO富集条目难以区分、相关性较小；而有参考组装的富集条目相对一致且与生长发育过程相关。比较分析表明，当有高质量参考基因组时，有参考转录组测序结果更准确高效。另外，与已发表的SE8菌株转录组数据比较，SE6和SE8在富集通路和关键基因上存在差异。SE8的重要通路是色氨酸代谢（ko00380），相关基因包括醛脱氢酶、真菌疏水蛋白、糖苷水解酶和AB水解酶超家族蛋白；SE6的重要通路是苯丙氨酸代谢（ko00360），相关基因为苯丙氨酸解氨酶、糖苷水解酶家族和醛酮还原酶家族。这种差异可能源于两菌株的差异——SE8为黄褐色菌株，SE6为白色菌株。已有报道表明苯丙氨酸解氨酶与食用菌颜色形成相关，这为后续研究P. edulis颜色形成机制提供了线索。

苯丙氨酸解氨酶是连接初生苯丙氨酸代谢与苯丙素次生代谢的枢纽酶和限速酶，在植物次生代谢物合成中广泛参与。该酶催化苯丙氨酸不可逆脱氨，形成反式肉桂酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸等中间代谢物，在食用菌的木质素降解、形态发生、防御机制和品质形成中发挥核心调控作用。多项研究证实PAL基因参与食用菌的发育和颜色形成，例如在糙皮侧耳中pal基因在生殖生长阶段的表达显著高于营养生长阶段，干扰pal1和pal2表达会延迟原基形成；在刺芹侧耳中发现PePAL1基因作为颜色开关基因影响菌盖颜色。本研究中，在P. edulis的SE6-P vs SE6-F和SE6-P vs SE6-M阶段发现了高表达的编码苯丙氨酸解氨酶的DEGs，该基因在不同发育阶段表现出不同表达，提示其可能参与P. edulis的发育转换，这与前人的研究结果一致。此外，该研究使用的野生P. edulis菌株为白色菌盖，与普通P. edulis在相同栽培条件下菌盖颜色差异显著。初步筛选到三个苯丙氨酸解氨酶基因，相关研究表明这些基因也参与食用菌的热胁迫和菌盖颜色形成。后续整合代谢组和蛋白质组数据，将有助于分析这些基因在P. edulis热胁迫响应和菌盖颜色形成中的功能机制，为耐高温菌株选育和菌盖颜色形成机制解析奠定基础。

结论：真菌全基因组和转录组测序的完成为研究遗传机制和遗传育种提供了有效手段。本研究生成了P. edulis SE6-23的35.21 Mb基因组序列，编码10,490个预测基因。同时，为SE6菌株的三个发育阶段（SE6-P、SE6-F和SE6-M）生成了总计57.14 Gb的转录组数据。与SE6-23参考基因组进行序列比对，发现2,966个新基因。差异表达基因分析显示，编码苯丙氨酸解氨酶的基因通过KEGG注释到苯丙氨酸代谢通路（ko00360），表明苯丙氨酸解氨酶调控L-苯丙氨酸形成P. edulis子实体。qRT-PCR验证了RNA-Seq和DEGs分析的准确性。总体而言，本研究旨在校准和改良P. edulis的基因组序列，丰富转录组数据库，并为未来P. edulis的精确基因定位、功能基因克隆和遗传育种提供理论基础。该研究论文发表在《Frontiers in Ecology and Evolution》。