转位蛋白拮抗剂ONO-2952减轻癫痫大鼠模型中的神经炎症和神经元凋亡

《Frontiers in Neurology》：The translocator protein antagonist ONO-2952 attenuates neuroinflammation and neuronal apoptosis in an epilepsy rat model

　　

癫痫是一种全球流行的慢性神经系统疾病，转位蛋白18 kDa (translocator protein 18 kDa, TSPO)介导的神经炎症在癫痫发病机制中起关键作用。本研究旨在通过建立成熟的癫痫大鼠模型，探讨转位蛋白18 kDa拮抗剂ONO-2952对癫痫神经炎症和认知功能的影响，将模型分为对照组、未治疗的癫痫持续状态(status epilepticus, SE)组和ONO-2952干预的SE组；进行认知和行为测试以观察大鼠的行为变化，采用免疫荧光染色检测神经元凋亡，采用流式细胞术分析免疫细胞浸润，并应用免疫印迹法测量促炎细胞因子的表达。结果表明，ONO-2952可下调转位蛋白18 kDa的表达，降低促炎细胞因子水平和外周免疫细胞浸润，从而抑制癫痫大鼠的神经炎症，并可减轻海马神经元凋亡，有效改善模型大鼠的认知功能障碍。本研究证实ONO-2952可调节转位蛋白18 kDa的表达，抑制神经炎症和神经元凋亡，改善癫痫大鼠的认知功能，但需要进一步研究以充分阐明其具体的生物学效应。

癫痫是一种全球常见的慢性神经系统疾病，全球约5000万患者受影响。现有抗癫痫药物仅能缓解症状，无法有效阻止疾病进展。癫痫可由单次发作、脑外伤、感染或卒中触发，但仅少数患者发展为以反复自发性发作为特征的慢性癫痫，这一过程依赖于初始损伤后大脑的渐进性病理改变，包括神经元异常兴奋性、神经回路重塑、血脑屏障破坏、炎症细胞浸润、胶质增生和细胞外基质重塑。这些病理变化共同构成癫痫发生的基础，并决定从急性脑损伤向慢性癫痫的转变。因此，探索初始脑损伤或首次发作后大脑病理演变的分子机制，并筛选阻断这一过程的关键靶点，是癫痫防治的核心科学问题。近年研究越来越表明，神经炎症在癫痫中起重要作用，发作可诱导神经炎症，反复发作维持炎症反应，导致神经元损伤，主要通过激活星形胶质细胞和小胶质细胞，促进促炎因子释放。转位蛋白18 kDa (translocator protein 18 kDa, TSPO)是一种线粒体蛋白，存在于中枢神经系统小胶质细胞中，主要功能是促进胆固醇跨膜转运，对于神经类固醇合成至关重要，也调节线粒体活性和凋亡。在正常大脑中，小胶质细胞低水平表达TSPO，但在病理条件下小胶质细胞激活时其表达急剧增加。在癫痫中，TSPO与电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)和腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine nucleotide translocator, ANT)相互作用形成线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)，过度开放导致线粒体功能障碍和促凋亡因子释放，同时促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，加剧线粒体损伤。反复发作触发胶质炎症并激活核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路，驱动TSPO持续过表达，升高的TSPO又放大NF-κB介导的炎症信号并激活NLRP3炎症小体，驱动促炎细胞因子产生和释放，导致神经元过度兴奋、血脑屏障破坏和神经元凋亡，形成恶性循环。鉴于TSPO在中枢神经系统的广泛分布和在神经炎症状态下的高表达，靶向TSPO可能是减轻神经炎症和减少神经元损伤的有效方法。ONO-2952是一种TSPO高亲和力配体，既往研究表明它在中枢神经系统损伤后促进神经存活并减少小胶质细胞激活，但尚无研究探讨ONO-2952对癫痫脑损伤和炎症的影响。本研究旨在通过建立成熟癫痫大鼠模型，探索ONO-2952对神经炎症和认知功能的影响。研究人员建立了锂-毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(status epilepticus, SE)大鼠模型，并分为对照组、未治疗的SE组和ONO-2952干预的SE组，通过认知行为测试、免疫荧光、流式细胞术和免疫印迹等技术，评估了ONO-2952对TSPO表达、促炎因子水平、外周免疫细胞浸润、海马神经元凋亡和认知功能的影响。研究得出结论：ONO-2952下调TSPO表达，降低促炎因子水平和外周免疫细胞浸润，抑制神经炎症，减轻海马神经元凋亡，改善认知功能障碍。该研究证实TSPO是癫痫的一个有前景的治疗靶点，并验证了ONO-2952作为辅助治疗的潜在候选药物。论文发表在《Frontiers in Neurology》。

主要关键的技术方法包括：使用雄性Sprague–Dawley大鼠（6–8周龄，250–300 g，购自SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.），通过腹腔注射氯化锂（127 mg/kg）和匹罗卡品（30 mg/kg）诱导癫痫持续状态，以地西泮终止发作，ONO-2952（1 mg/kg，口服）从匹罗卡品注射前2小时开始每日给药。主要技术方法有：Morris水迷宫测试评估空间学习记忆能力（训练4天，第7天进行探测试验）；免疫印迹法检测脑组织TSPO、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达；免疫荧光和TUNEL双染检测海马CA1区神经元凋亡；流式细胞术分析脑浸润白细胞，包括CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞（采用Percoll梯度分离单核细胞，染色后定量）。所有数据以均值±标准误表示，组间比较采用单因素方差分析及Tukey事后检验，显著性水平设为p < 0.05。

研究结果：
3.1 癫痫持续状态严重程度评估：对照组无发作行为；SE组和SE+ONO-2952组达到IV–V级发作的平均潜伏期分别为38.89±2.62 min和39.78±2.68 min，无显著差异（p > 0.05），两组达到V级发作的大鼠比例相同（55%，各9只中5只），确认模型成功建立。
3.2 TSPO在癫痫大鼠脑中上调，ONO-2952逆转此上调：免疫印迹结果显示，SE模型组TSPO表达显著高于对照组（*p < 0.05），而ONO-2952治疗组TSPO表达显著低于模型组（#p < 0.05），表明ONO-2952有效逆转发作驱动的TSPO上调。
3.3 ONO-2952改善SE后的认知缺陷：Morris水迷宫测试中，各组总游泳距离和平均速度无显著差异（p > 0.05），排除运动功能影响。探测试验中，SE组平台穿越次数和靶象限路径长度百分比显著低于对照组（p < 0.05），显示空间记忆保留受损；ONO-2952治疗组这些指标部分但显著恢复，平台穿越次数增加但未达对照组水平。同时，免疫荧光和TUNEL双染显示，SE组海马CA1区TUNEL⁺/NeuN⁺细胞数显著增加（*p < 0.05），ONO-2952给药显著减少神经元凋亡（#p < 0.05），表明认知改善与海马神经保护相关。
3.4 ONO-2952降低癫痫大鼠脑组织中炎症因子表达：与对照组相比，SE模型组IL-6、IL-1β和TNF-α表达显著升高；ONO-2952治疗有效降低这些标志物水平，所有变化具有统计学意义（*p < 0.05, #p < 0.05），表明神经炎症减轻。
3.5 ONO-2952限制外周免疫细胞浸润至脑实质：流式细胞术分析显示，与对照组相比，SE模型组脑浸润CD4⁺ T细胞（CD45^hiCD3⁺CD4⁺）、B细胞（CD45^hiCD19⁺）、中性粒细胞（CD11b⁺Ly6G⁺）和巨噬细胞（CD11b⁺CD68⁺）比例显著增加（*p < 0.05），ONO-2952治疗显著减少这些亚群的比例（#p < 0.05），而CD8⁺ T细胞比例无显著变化。

讨论部分总结：本研究在锂-毛果芸香碱诱导的癫痫大鼠模型中，证实选择性TSPO拮抗剂ONO-2952可减轻神经炎症并改善认知功能。急性发作参数（潜伏期和V级发作比例）在SE组和SE+ONO-2952组间无显著差异，但样本量有限，尚不能得出ONO-2952具有直接抗惊厥活性的结论。TSPO在癫痫大鼠脑组织中表达显著上调，ONO-2952有效逆转此上调，确认其靶点参与。TUNEL染色显示ONO-2952减少海马CA1区凋亡神经元，提示通过保持线粒体完整性抑制下游凋亡级联发挥神经保护作用。同时，IL-1β、IL-6和TNF-α表达降低，外周免疫细胞浸润减少，进一步支持抗炎效应。Morris水迷宫测试显示ONO-2952恢复认知表现，与海马神经元凋亡减少一致。本研究存在局限性：所有检测和行为评估均在急性期进行，未监测慢性自发发作；ONO-2952在SE诱导前2小时预防性给药，无法模拟临床干预时机；结果仅基于锂-毛果芸香碱模型，需在其他癫痫模型中验证。研究结论翻译：总之，ONO-2952减轻癫痫大鼠的神经炎症并改善认知障碍。其潜在机制包括抑制细胞因子释放、限制外周免疫细胞募集以及保护海马神经元。这些结果提示TSPO是癫痫的一个有前景的治疗靶点，并验证了ONO-2952作为辅助治疗的潜在候选药物。