《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Deciphering mechanisms of environmental adaptation, antibiotic tolerance, and potential virulence traits of
Pseudomonas baetica isolated from anthropogenic habitat
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摘要自然和人工环境中的抗生素残留对公共健康构成潜在风险，特别是通过适应性耐受反应增强机会性病原体的持久性。然而，抗生素胁迫下环境适应的机制以及耐受性和毒力相关性状协调调控的机制仍未被充分揭示。本研究分离了贝氏假单胞菌（Pseudomonas baetica）MZ-1。发生情况
摘要
自然和人工环境中的抗生素残留对公共健康构成潜在风险，特别是通过适应性耐受反应增强机会性病原体的持久性。然而，抗生素胁迫下环境适应的机制以及耐受性和毒力相关性状协调调控的机制仍未被充分揭示。本研究分离了贝氏假单胞菌（Pseudomonas baetica）MZ-1。发生情况分析显示，MZ-1 的 16S rRNA 系统发育类型在包括人类相关环境在内的多种地理区域和环境栖息地中均被检测到。基于 MZ-1 基因组的分析表明其具有广泛的环境适应性、代谢多样性以及潜在的抗生素敏感性降低。表型测定证实了多药耐受性。转录组分析揭示了其对土霉素（OT）胁迫的多层次反应。在 OT 胁迫下，与胞外信号感知和鞭毛调节相关的基因差异表达，表明运动性相关反应在 OT 适应中可能发挥作用。显著上调的抗 sigma 因子 FlgM 可能有助于抑制高能耗的鞭毛组装。与膜包被相关的反应可能通过增加 PNAG 相关多糖输出和改变孔蛋白表达来增强细胞保护。外排泵基因，特别是与 MexEF-OprN 系统相关的基因，在 OT 胁迫下被上调，并可能对 OT 耐受性做出贡献。分子对接模拟预测 OT 与 MexF 稳定结合（ΔG=-7.8 kcal/mol），基于结构分析表明 OT 与 MexF 之间存在潜在相互作用。显著上调的 ExoU 表明在抗生素胁迫下保留了毒力相关 III 型分泌系统效应子的表达潜力。这些发现揭示了 P. baetica MZ-1 的抗生素胁迫反应和毒力相关特征，并表明相关系统发育类型可能分布在受人类影响的生态系统中。
引言
抗生素的滥用和不完整的生物转化导致自然土壤和水生系统 [1] 以及人工废水处理系统 [2] 中抗生素抗性基因（ARGs）的维持和传播面临持续的选择压力。抗生素耐受性或抗性的全球蔓延已成为公共健康面临的最严峻挑战之一 [3]，[4]。在环境栖息地中持久存在同时保留感染宿主能力的机会性病原体，如假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter），构成了特别高风险的群体。这些微生物在抗生素胁迫下可能表现出敏感性降低，并在选择性压力下在抗生素影响的环境中持久存在 [5]，[6]。它们也可能携带有助于在多种栖息地中生存的抗生素相关性状，并通过包括食物链在内的各种途径从自然和人工栖息地传播到牲畜和人类 [6]。因此，这些生物体可能有助于抗生素相关适应性性状在相互连接的栖息地中的环境持久性，从而对公共健康构成重大风险。
贝氏假单胞菌（Pseudomonas baetica）是假单胞菌属中最近描述的一个物种，其在养殖系统中的致病性日益受到关注 [7]。虽然最初在特定宿主中被鉴定出来，但随后的调查显示其有能力在不同季节感染多种海洋鱼类，包括塞内加尔比目鱼、欧洲鲈鱼和欧鲻，造成重大的经济损失 [8]。其分泌胞外蛋白酶的能力进一步强调了其致病潜力，这是与铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）毒力相关的一个常用指标。Beaton 等人（2018）报道，P. baetica 分泌的蛋白酶少于 P. aeruginosa，但多于 P. fluoresces Pf01 和 P. putida KT2440。进一步的比较基因组分析表明存在 III 型分泌系统（T3SS），这是一种在许多革兰氏阴性菌中通常与宿主相互作用和毒力相关的分泌装置 [9]。除了致病性之外，P. baetica 还表现出有趣的与抗生素耐受性相关的表型。之前的一项研究报告了 P. baetica 对四环素类抗生素（如土霉素）的耐受性 [9]。然而，在 P. baetica 菌株的基因组中未发现编码四环素抗性 Tet 酶的基因，表明其对抗生素胁迫的耐受性可能依赖于生理适应性反应，而不是遗传编码的抗性机制。除了养殖环境外，P. baetica 还在砷污染土壤和豆科植物根系中被检测到 [10]，[11]，表明其具有栖息于环境差异显著生态位中的潜力。这些发现表明，P. baetica 具有相当大的生态多样性，可能存在于一系列自然和人类相关的环境中。然而，由于研究有限，其分布模式、生态适应性策略以及在抗生素胁迫下采用的具体防御机制尚未得到全面评估。
在本研究中，从一个人工影响环境的人工湖中分离出一株贝氏假单胞菌（Pseudomonas baetica），命名为 P. baetica MZ-1。探索了 MZ-1 16S rRNA 系统发育类型的环境发生模式，以及 MZ-1 的适应性反应和毒力相关遗传特征。利用公开可用数据集，基于 99% 的序列一致性阈值，评估了 MZ-1 16S rRNA 系统发育类型在多种栖息地中的发生情况。表征了 P. baetica MZ-1 的表型和基因组特征，并注释了与抗生素耐受性相关的性状以及与毒力相关的基因。实验评估了其对抗生素的反应。此外，整合转录组分析和分子对接，以深入了解抗生素胁迫反应策略以及抗生素暴露下毒力相关基因表达的变化。在此，我们旨在阐释：（1）MZ-1 16S rRNA 系统发育类型的分布特征；（2）MZ-1 的适应策略；以及（3）MZ-1 中抗生素胁迫耐受机制和毒力相关基因表达反应。
章节片段
菌株分离、鉴定及表型表征
菌株 MZ-1 分离自中国重庆市的一个人工湖。详细的分离和纯化程序描述于补充材料（方法部分）。纯化的菌株被命名为 MZ-1，保存在 -80 °C 的 40%（v/v）甘油中用于长期储存。
使用通用引物 27F 和 1492R 在补充材料（方法部分）描述的 PCR 条件下扩增全长 16S rRNA 基因。所得序列为
MZ-1 16S rRNA 系统发育类型的环境发生情况
从 MAP 数据库中检索到 1,002 个包含与 MZ-1 至少 99% 一致性的 16S rRNA 基因序列的样本。结果显示，在可用的 MAP 数据集 [中，所有有人居住的 continent 上都检测到了与 MZ-1 ≥ 99% 一致性的 16S rRNA 基因序列 (图 1a)，在北半球温带地区（例如欧洲和北美）的检测更为频繁。排除缺乏明确环境信息的样本后，MZ-1
结论
在本研究中，分离并表征了贝氏假单胞菌（Pseudomonas baetica）MZ-1，发现 MZ-1 16S rRNA 系统发育类型存在于多种环境栖息地中，包括人类相关和人工环境。整合基因组、表型和转录组分析表明，尽管缺乏典型的四环素抗性决定因子，但 MZ-1 表现出对土霉素的耐受性。这种耐受性与涉及 PNAG 相关生物膜的协调适应性反应有关
CRediT 作者贡献声明
刘继成：监督，概念化。陈友朋：监督，项目管理，资金获取。付慧敏：监督，资源，概念化。毛远翔：监督，资源。张牧琦：写作 - 初稿，可视化，验证，软件，调查。高梦娇：写作 - 审阅与编辑，监督，资金获取。秦银秋：软件，调查，数据整理。严鹏：监督，形式分析。王一程：
竞争利益声明
作者声明，他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（52570027）、重庆市科学技术局（CSTB2023NSCQ-LZX0095）、重庆市创业创新支持计划（cx2024032）和重庆市人才计划（CSTB2024YCJH-KYXM0077）的财政支持。
Mu-Qi Zhang|Yi-Cheng Wang|Ming-Ying Mao|Yin-Qiu Qin|Peng Yan|Hui-Min Fu|Yuan-Xiang Mao|Ji-Cheng Liu|You-Peng Chen|Meng-Jiao Gao
教育部三峡库区生态环境重点实验室，环境生态学院，重庆大学，中国 重庆 400044
