沙丁鱼肌动球蛋白中由微生物和内源性转谷氨酰胺酶诱导的蛋白质交联与网络形成

《Sustainable Food Technology》：Protein cross-linking and network formation in sardine actomyosin induced by microbial and endogenous transglutaminasesOpen Access

　　

转谷氨酰胺酶被广泛用于增强肌肉蛋白的凝胶化；然而，其对暗色鱼肉肌动球蛋白的机制影响仍不够明确。研究人员研究了在受控热处理条件（25 °C/4 h和40 °C/2 h）下，内源性鱼类转谷氨酰胺酶（FTGase）和微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）对沙丁鱼天然肌动球蛋白（NAM）诱导的结构和功能修饰。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析揭示了依赖于处理方式的构象转变，其特征是α-螺旋含量减少，β-折叠和无规卷曲结构增加，特别是在MTGase处理的样品中。这些重排与更大的构象灵活性相一致，可能有利于交联的形成。酶处理显著降低了蛋白质溶解度和巯基含量，同时增加了二硫键的形成，这与蛋白质的渐进聚合相一致。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证明了肌球蛋白重链的广泛聚集，尤其是在40 °C下的MTGase系统中。流变学测量显示所有样品均表现出弹性主导行为（G′ > G″），其中经MTGase处理的NAM表现出最高的储能模量（G′）和最低的损耗角正切（tan δ）值，表明形成了更强且更不可逆的凝胶网络。扫描电子显微镜（SEM）显微照片证实了这些发现，显示在酶辅助系统中基质更致密且互连更紧密。重要的是，Ca²⁺-ATPase活性在很大程度上不受酶处理的影响，表明TGase处理并未明显损害与肌球蛋白头部相关的催化活性。定量图像分析进一步证实了这些观察结果，显示蛋白质面积分数和表观空隙率的变化取决于酶的类型和热处理，反映了网络致密度和孔隙率的差异。这些结果表明，受控的热-酶处理增强了沙丁鱼肌动球蛋白中的网络固化，其中MTGase表现出更优的交联效率。这些发现为鱼糜生产中未充分利用的中上层鱼类凝胶化增强的机制提供了见解。

近年来，鱼糜制品因其高蛋白、低脂肪和良好的质构特性而备受青睐。传统鱼糜生产依赖白鱼肉鱼类，但资源衰退促使人们关注沙丁鱼等暗色肉中上层鱼类。然而，沙丁鱼凝胶形成能力较弱，主要归因于高脂肪、高肌浆蛋白含量及暗色肌肉中促氧化血红素化合物的存在，这些因素干扰了肌动球蛋白相互作用和网络形成。肌动球蛋白是三维凝胶网络的结构骨架，其凝胶能力直接影响最终产品的质构、弹性和持水性。转谷氨酰胺酶（TGase，EC 2.3.2.13，催化酰基转移反应形成共价键的酶）能改善蛋白质凝胶特性。尽管内源性TGase参与肌肉修饰，但在水洗过程中易流失，常需补充微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）。目前，内源性和微生物TGase系统在沙丁鱼肌肉蛋白中的比较行为尚不明确。因此，研究人员在受控热条件下，探讨了FTGase和MTGase对沙丁鱼天然肌动球蛋白（NAM，肌球蛋白和F-肌动蛋白的复合物）结构重排、交联行为和凝胶形成特性的影响。结果表明，受控的热-酶处理增强了沙丁鱼肌动球蛋白的网络固化，MTGase表现出更优的交联效率。该研究发表在《Sustainable Food Technology》上，为利用未充分利用的中上层鱼类增强鱼糜凝胶化提供了理论依据，支持了资源效率和增值加工的可持续发展目标。

研究人员从沙丁鱼肌肉中提取了NAM，并在25 °C/4 h和40 °C/2 h条件下，分别加入内源性鱼类转谷氨酰胺酶（FTGase）和MTGase进行处理。主要采用了以下关键技术方法：傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于分析蛋白质二级结构变化；分光光度法测定Ca²⁺-ATPase活性、蛋白质溶解度、总巯基（TSH）和二硫键（DB）含量以及表面疏水性（S₀^ANS）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白质聚合模式；动态流变学测量评估粘弹性；扫描电子显微镜（SEM）结合定量图像分析观察微观结构和网络致密度。

3.1. NAM的分子和构象重排（FTIR）
通过FTIR光谱和酰胺I带去卷积分析发现，热处理和TGase交联导致NAM发生构象转变。α-螺旋含量逐渐减少，无规卷曲和β-折叠结构增加，特别是在MTGase处理的样品中。这表明处理引起了构象重排和结构灵活性增加，可能有利于谷氨酰胺和赖氨酸残基暴露，从而促进交联形成。

3.2. 共价稳定和交联证据
通过生化指标测定和SDS-PAGE分析得出，Ca²⁺-ATPase活性随温度显著下降，但不受TGase处理显著影响，表明TGase未明显损害肌球蛋白头部催化功能。酶处理显著降低了蛋白质溶解度和TSH含量，增加了DB形成，MTGase效果最强。表面疏水性显著增加，SDS-PAGE显示MTGase处理样品中肌球蛋白重链广泛聚合。这证明了受控热-酶处理促进了蛋白质交联、聚合和氧化稳定。

3.3. 流变行为
通过振荡频率扫频流变测量发现，所有样品的储能模量（G′）均高于损耗模量（G″），表现出弹性主导的凝胶行为。MTGase处理的NAM表现出最高的G′和最低的损耗角正切（tan δ）值，表明高温促进了部分展开和酶活性，形成了更强、更稳定的不可逆凝胶网络。

3.4. 微观结构分析（SEM）
通过SEM观察和定量图像分析发现，未经处理的NAM呈松散颗粒状。加入TGase后，网络更致密均匀。40 °C/2 h时，FTGase维持了互连海绵状结构，而MTGase呈现高度致密但非均一的形态。蛋白质面积分数和表观空隙率的变化反映了网络致密度的差异，支持了流变学发现。

该研究全面评估了内源性和微生物转谷氨酰胺酶与温和热处理对沙丁鱼NAM结构和功能的调节作用。两种酶系统均促进了蛋白质交联和网络发育，但MTGase始终表现出更高的催化效率，导致更大的构象重排、更低的溶解度、增强的二硫键形成以及更显著的肌球蛋白重链聚合。FTIR去卷积表明的部分展开与增强的蛋白缔合和交联一致。流变分析显示所有处理系统均表现为弹性凝胶，其中MTGase辅助网络具有最高G′和最低tan δ值。SEM观察证实酶处理样品基质更致密且互连更紧密。重要的是，TGase处理未明显损害Ca²⁺-ATPase活性，表明交联过程中肌球蛋白头部催化功能相对保留。这些发现强调了受控热-酶处理在改善沙丁鱼肌动球蛋白凝胶强度、网络组织和结构稳定性中的作用。结合适度加热的MTGase是克服暗色鱼肉凝胶化限制的有效工具，为优化TGase辅助加工和更广泛地利用沙丁鱼及其他未充分利用的中上层鱼类资源提供了实践指导。