《Analytical Cellular Pathology》：Deciphering HPV-Associated Immune Evasion in Cervical Cancer Through Multi-Omics Profiling and Computational Screening
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背景：人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宫颈癌（cervical cancer，CC）的主要诱因，但HPV相关免疫逃逸的分子机制仍不明确。方法：研究人员分析了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas
背景：人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宫颈癌（cervical cancer，CC）的主要诱因，但HPV相关免疫逃逸的分子机制仍不明确。方法：研究人员分析了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）-CESC的批量RNA-seq数据和来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）的单细胞RNA-seq数据集（GSE171894、GSE197461），以阐明HPV阳性与HPV阴性宫颈肿瘤之间的转录组和免疫景观差异。使用DESeq2鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）方法进行功能富集分析。采用LASSO、随机森林（Random Forest）和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）技术筛选免疫逃逸特征基因。构建了转录因子和miRNA的调控网络。使用CIBERSORT和单样本基因集富集分析（single-sample GSEA，ssGSEA）评估免疫浸润。通过实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和Western blot在CC细胞系（HeLa、SiHa、C33A和W12）中验证关键特征基因的表达。通过siRNA介导的敲低研究IFNGR1的功能，并辅以CCK-8、集落形成、Transwell迁移/侵袭和流式细胞凋亡实验。结果：共鉴定出6266个DEGs，有效区分了HPV阳性和阴性肿瘤。HPV阳性肿瘤在病毒感染和免疫应答通路中富集，而HPV阴性肿瘤则显示致癌信号通路激活。机器学习算法确定IFNGR1、TRADD和PSMB9为HPV相关的免疫逃逸特征基因。调控网络分析强调了IRF1/IRF2和多个miRNA是关键调控因子。免疫浸润分析显示，HPV阳性肿瘤中树突状细胞和浆细胞浸润增加，且与TRADD表达相关。Kaplan-Meier分析进一步表明，IFNGR1高表达的HPV阳性患者总生存期（overall survival，OS）有更差的趋势（风险比[hazard ratio，HR] = 1.78，95%置信区间[confidence interval，CI]：0.86–3.68；log-rank p = 0.113）。值得注意的是，IFNGR1在HPV阳性CC细胞系中mRNA和蛋白水平均显著上调。敲低IFNGR1显著抑制了HeLa和SiHa细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，同时增强了凋亡，从而证实了其在HPV相关CC进展中的关键作用。结论：本研究将IFNGR1确定为HPV阳性CC中一个关键的免疫逃逸相关基因，阐明了其调控网络和功能贡献，并定位其为HPV相关肿瘤的潜在治疗靶点。
**论文解读：多组学分析与计算筛选揭示HPV相关宫颈癌免疫逃逸机制**
**研究背景与问题**
宫颈癌（cervical cancer，CC）是全球女性中发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一，尤其在低中收入国家形势严峻。高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持续感染，特别是HPV16和HPV18亚型，被认为是导致宫颈癌变的主要病因，约99.7%的CC病例归因于HR-HPV感染。HR-HPV通过促进细胞增殖失控、基因组不稳定性以及调控宿主抗病毒和免疫反应来逃避免疫监视，从而驱动恶性转化。然而，HPV阳性CC中免疫逃逸的具体分子决定因素和调控通路仍不充分明确。尤其是连接HPV相关致癌信号与免疫调节的关键基因，以及它们在HPV阳性与阴性肿瘤间的表达差异，亟待进一步阐明。深入理解这些免疫相关分子特征对于识别HPV相关CC的新生物标志物和治疗靶点至关重要。该研究发表于《Analytical Cellular Pathology》。
**研究方法概述**
研究人员整合了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）-CESC队列（含178例有HPV状态的肿瘤样本：169例HPV阳性、9例HPV阴性）的批量RNA-seq数据，以及来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）的单细胞RNA-seq数据集（GSE171894：4例CC样本，2例HPV阳性、2例HPV阴性；GSE197461：8例CC样本，6例HPV阳性、2例HPV阴性）。主要技术方法包括：利用DESeq2进行差异表达分析；通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）进行功能富集分析；采用LASSO、随机森林（Random Forest）和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）三种机器学习算法筛选免疫逃逸特征基因；使用CIBERSORT和单样本基因集富集分析（single-sample GSEA，ssGSEA）评估免疫浸润；在宫颈癌细胞系HeLa（HPV18+）、SiHa（HPV16+）、C33A（HPV阴性）和正常角质形成细胞系W12中通过RT-qPCR和Western blot验证表达；通过siRNA敲低IFNGR1后进行CCK-8、集落形成、Transwell迁移/侵袭和流式细胞凋亡实验。
**研究结果**
**3.1 差异表达分析**：在HPV阳性与阴性肿瘤之间共鉴定出4266个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中2635个上调、1631个下调，并通过火山图和热图展示了表达模式。
**3.2 功能富集分析**：GSEA显示HPV阳性组富集于病毒感染（如单纯疱疹病毒1感染、甲型流感）和免疫相关通路（如IL-17信号、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、NOD样受体信号、抗原加工呈递）；HPV阴性组则富集于经典肿瘤相关通路（如Wnt信号、Hedgehog信号、Rap1信号）。
**3.3 机器学习筛选特征基因**：将DEGs与已知免疫逃逸基因集（180个人类同源基因）取交集，获得11个免疫逃逸相关基因。LASSO、随机森林和SVM-RFE三种算法均筛选出IFNGR1、TRADD和PSMB9作为HPV相关免疫逃逸特征基因，并在HPV阳性组中表达上调。
**3.4 GO和KEGG富集分析**：GO分析显示特征基因显著富集于干扰素相关通路（如III型干扰素介导的信号通路、II型干扰素受体活性）；KEGG分析显示富集于坏死性凋亡通路及多种病毒感染相关通路（如甲型流感、结核病、单纯疱疹病毒感染）。
**3.5 调控网络分析**：转录因子分析表明IRF2可能抑制IFNGR1转录，IRF1正向调控PSMB9表达；miRNA调控网络提示hsa-miR-370-3p、hsa-miR-425-5p和hsa-miR-136-5p可能靶向IFNGR1进行降解。
**3.6 免疫浸润分析**：HPV阳性组中活化树突状细胞、浆细胞和静息树突状细胞浸润水平显著高于HPV阴性组，而M0巨噬细胞在HPV阴性组中显著升高。TRADD表达与活化树突状细胞浸润呈正相关。
**3.7 单细胞图谱构建**：通过质控获得49,560个高质量细胞（HPV阳性35,368个，HPV阴性14,192个），利用拷贝数变异（copy number variation，CNV）分析鉴定出6个肿瘤细胞簇（簇1、4、6、13、16、34）。
**3.8 特征基因表达的细胞类型识别**：ssGSEA显示特征基因在HPV阳性组的上皮细胞和髓系细胞中高度富集，且IFNGR1和TRADD在免疫细胞中表达差异最大，PSMB9在免疫细胞和肿瘤细胞中均有显著差异。
**3.9 生存分析**：在HPV阳性TCGA-CESC队列（n=167）中，IFNGR1高表达患者总生存期（overall survival，OS）有更差趋势（HR=1.78，95% CI：0.86–3.68；log-rank p=0.113），而TRADD和PSMB9表达与OS无显著关联。
**3.10 IFNGR1在HPV阳性CC细胞中高表达**：RT-qPCR和Western blot证实IFNGR1、TRADD和PSMB9在HPV阳性细胞系HeLa和SiHa中mRNA和蛋白水平均显著高于HPV阴性C33A和正常角质形成细胞W12，且IFNGR1在HPV阳性细胞中表达最高。
**3.11 敲低IFNGR1抑制HPV阳性CC细胞功能**：siRNA敲低IFNGR1后，HeLa和SiHa细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力显著下降，而凋亡率显著升高，表明IFNGR1促进HPV阳性CC的恶性表型。
**讨论与结论**
**讨论总结**：本研究系统揭示了HPV阳性与阴性CC的分子和细胞差异，鉴定出6266个DEGs，并发现HPV阳性肿瘤中免疫相关通路（尤其是干扰素信号和病毒应答）显著富集。通过机器学习筛选出IFNGR1、TRADD和PSMB9作为关键免疫逃逸特征基因。单细胞转录组分析显示这些基因主要在上皮细胞和髓系细胞中表达，并与免疫细胞浸润相关。功能实验证实沉默IFNGR1可抑制HPV阳性CC细胞的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡，提示其促癌作用。IFNGR1编码IFN-γ受体的配体结合链，其上调可能通过维持低水平IFN-γ信号促进JAK-STAT通路活性，同时诱导细胞对细胞毒性免疫压力产生耐受。TRADD作为衔接蛋白，其升高可能将信号从凋亡转向NF-κB介导的存活信号。PSMB9（免疫蛋白酶体催化亚基）失调可能损害MHC-I类分子抗原呈递，降低CD8
+细胞毒性T淋巴细胞的识别和杀伤。免疫浸润分析显示HPV阳性肿瘤中树突状细胞和浆细胞浸润增加，提示抗原呈递尝试增强但功能失调，而M0巨噬细胞在HPV阴性肿瘤中升高，提示不同的免疫逃逸途径。生存分析进一步支持IFNGR1高表达与较差OS的可能关联。研究局限性包括：依赖公共数据集导致的潜在偏倚、批次效应、肿瘤异质性、IFNGR1调控网络仅基于生物信息学预测、未评估HPV基因型特异性效应。
**结论翻译**：本研究整合了批量与单细胞转录组学，阐明了CC中先前未被识别的HPV相关免疫逃逸特征和调控网络，将IFNGR1、TRADD和PSMB9确定为关键免疫逃逸基因。这些发现推进了对HPV介导的免疫逃逸机制的理解，并突出了IFNGR1作为HPV阳性CC治疗干预的潜在分子靶点，进一步生存分析表明IFNGR1高表达可能与HPV阳性CC患者更差的总生存期相关。
