SPP1驱动的空间生态位重塑定义上尿路上皮癌基底亚型的侵袭性进展

《Clinical and Translational Medicine》：SPP1-driven spatial niche remodelling defines aggressive progression in the basal subtype of upper tract urothelial carcinoma

　　

背景：上尿路上皮癌（UTUC）是一种罕见且侵袭性强的恶性肿瘤，占尿路上皮癌的5%–10%。其基底亚型研究不足，但优先与肌层浸润和更差疾病特异性生存（DSS）相关。尽管UTUC的基因组景观已广泛解析，但当前的批量转录组分类无法解决细胞异质性或空间组织，可能掩盖了亚型特异性的微环境程序。
方法：研究人员整合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST），以解析UTUC微环境中分子亚型、肌层浸润和细胞异质性之间的关系。细胞通讯和多尺度空间分析识别了空间程序，并通过多重免疫荧光（mIF）进行组织水平验证。这些程序进一步在涵盖单细胞、空间和GeoMx平台的外部膀胱癌数据集中进行了检验。在J82细胞中进行SPP1敲低以评估上皮细胞内在效应。研究人员在日本-UTUC队列中评估了SPP1的亚型判别和预后相关性。
结果：基底UTUC表现出免疫-基质富集的微环境，主要与分子亚型而非病理分期相关。在基底肿瘤内，肌层浸润伴随着异质性增加和两个空间程序。一个保守的SPP1⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAM）–FAP⁺肌成纤维细胞边界程序与髓系免疫抑制和细胞外基质（ECM）重塑相关。外部数据集为其组成和位于侵袭边缘的基底高上皮附近提供了收敛支持。一个更具异质性的血管生成程序涉及VEGFA⁺肿瘤相关中性粒细胞（TAN）–CXCR4⁺尖端内皮细胞相互作用。在上皮水平，SPP1敲低降低了J82细胞的活力、迁移和侵袭。SPP1能区分基底和管腔肿瘤（受试者工作特征曲线下面积（AUC）=0.839），且在病理分期调整后，高表达仍与更差的DSS相关（风险比（HR）=1.17，95%置信区间（CI）=1.01–1.35，p=0.036）。
结论：基底UTUC具有一个很大程度上独立于分期的免疫-基质富集背景，该背景随肌层浸润发生空间重组，其中SPP1相关的髓系-基质边界程序是其最可重复的特征。空间、功能和临床证据支持SPP1的预后价值，并值得将其作为治疗靶点进行评估。

**论文解读：SPP1驱动的空间生态位重塑定义上尿路上皮癌基底亚型的侵袭性进展**

**研究背景**
上尿路上皮癌（UTUC）是一种罕见的侵袭性恶性肿瘤，占尿路上皮癌的5%–10%，其临床行为较膀胱癌（BCa）更为凶险，约60%的患者初诊时即为肌层浸润（MI）状态。尽管UTUC的基因组特征已得到广泛描述，但基因组改变仅能部分解释其发病机制。当前UTUC的分子分型主要沿用BCa分类框架，其中管腔亚型占主导（>80%），表现为免疫荒漠表型和相对较好的预后；而基底亚型虽然比例较小，但在MI肿瘤中富集，且侵袭性更强，贡献了不成比例的UTUC相关死亡率。然而，现有研究主要依赖批量转录组学，其分辨率有限，无法区分肿瘤、基质和免疫细胞的贡献，且可能混淆亚型信号。此外，分子亚型和病理分期如何塑造UTUC肿瘤微环境（TME）的组成和空间组织仍不清楚，尤其对于基底亚型，其细胞异质性、空间结构及潜在治疗脆弱性尚未得到充分表征。因此，研究人员开展了这项研究，旨在解析基底UTUC的TME异质性和空间组织，并探索其与侵袭性进展的关系。

**研究内容与结论**
研究人员整合了内部单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）数据，结合外部日本-UTUC批量队列（n=158）及多个膀胱癌公共数据集，系统分析了基底UTUC的微环境特征。研究发现，基底UTUC表现出一个很大程度上独立于病理分期的免疫-基质富集背景，这一特征主要与分子亚型相关。在基底肿瘤中，肌层浸润与两个空间程序的重组相关：一个保守的SPP1⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAM）–FAP⁺肌成纤维细胞癌相关成纤维细胞（myCAF）边界程序，以及一个更具异质性的VEGFA⁺肿瘤相关中性粒细胞（TAN）–CXCR4⁺尖端内皮细胞（EC）血管生成程序。SPP1⁺ TAM–FAP⁺ myCAF程序在侵袭边界富集，与髓系免疫抑制和细胞外基质（ECM）重塑相关，且该程序在外部膀胱癌数据集中得到验证。功能实验表明，在J82细胞中敲低SPP1可降低细胞活力、迁移和侵袭能力，且其条件培养基可损害人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的管形成能力，提示SPP1具有上皮细胞内在的促恶性行为作用。临床分析显示，SPP1能有效区分基底与管腔肿瘤（AUC=0.839），且在病理分期调整后，SPP1高表达仍与更差的疾病特异性生存（DSS）显著相关（HR=1.17，95%CI 1.01–1.35，p=0.036），表明SPP1是一个具有预后价值的生物标志物和治疗靶点。该研究发表在《Clinical and Translational Medicine》。

**主要技术方法**
本研究采用的主要关键技术方法包括：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）：对7例原发性UTUC患者的新鲜肿瘤组织（含3例配对癌旁正常组织）进行解离、建库和测序，使用BD Rhapsody平台，经质量控制后鉴定主要细胞类型；2）空间转录组学（ST）：对3例基底UTUC肿瘤（1例非肌层浸润NMI和2例肌层浸润MI）进行Visium空间基因表达分析，通过cell2location进行细胞类型反卷积；3）多重免疫荧光（mIF）：使用TSA法对MI基底肿瘤进行多轮染色，验证SPP1、FAP、CXCR4等标记物的空间共定位；4）外部数据集验证：利用TCGA-BLCA、GSE32894、GSE222315、GSE267718、GSE299573、GSE319536和GSE296955等公共膀胱癌数据集，涵盖批量转录组、单细胞、空间和GeoMx平台；5）功能实验：在J82细胞系中进行siRNA介导的SPP1敲低，通过CCK-8、Transwell迁移和侵袭实验及HUVEC管形成实验评估细胞表型变化。

**研究结果**
**2.1 基底UTUC表现出独立于分期的免疫-基质富集景观**
通过日本-UTUC队列分析，基底肿瘤在NMI和MI组中均比管腔肿瘤具有更高的ImmuneScore和StromalScore，且免疫-基质富集表型主要与分子亚型相关，而非病理分期。ST和免疫组化验证了基底肿瘤中SPP1和FAP的跨分期高表达。

**2.2 UTUC恶性上皮细胞的发育和空间异质性**
通过inferCNV识别恶性上皮细胞，并重新聚类为5个亚簇（Cancer_c0–c4）。Cancer_c3具有独立的轨迹和调控子谱，富集缺氧、糖酵解和血管生成程序，在MI基底肿瘤中更靠近肿瘤边界，且与较差DSS相关。在外部BCa数据中，Cancer_c3评分沿基底-管腔轴增加，在日本-UTUC队列中与肌层浸润相关。

**2.3 髓系区室的阶段相关空间重塑**
单核细胞-巨噬细胞轨迹从Mono_c3_CCR2单核细胞分化至Macro_c0_SPP1巨噬细胞（SPP1⁺ TAMs），在MI基底切片中这两个状态的空间共富集增强，且M2极化信号升高。中性粒细胞分析鉴定出Neu_c0_MME（有利预后）和Neu_c2_VEGFA（VEGFA⁺ TANs，不利预后），后者在MI基底切片中与Cancer_c3的空间关联更强，并富集缺氧、糖酵解和炎症反应程序。

**2.4 UTUC中淋巴细胞的异质性**
淋巴细胞重新聚类鉴定出B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、NK细胞和浆细胞亚群，具有不同的功能和预后关联。基底肿瘤中富集细胞毒性/耗竭T细胞、FOXP3⁺ Treg及空间T细胞抑制/Treg程序，而NMI样本中观察到TLS样区域。

**2.5 基质-内皮细胞异质性与重塑**
间充质细胞重新聚类包括CAF_c3_FAP（FAP⁺ myCAFs），其表现为肌成纤维细胞、基质产生表型，富集EMT和糖酵解，myCAF评分与基底评分和TGF-β信号正相关。内皮细胞分析鉴定出Endo_c1_CXCR4（CXCR4⁺ tip ECs），为尖端样状态，富集缺氧相关信号，其评分与myCAF和缺氧评分正相关。空间映射显示FAP⁺ myCAFs和CXCR4⁺ tip ECs在MI基底切片中更突出，而SMCs和动脉ECs在NMI基底切片中更突出。

**2.6 SPP1⁺ TAMs–FAP⁺ myCAF在MI基底UTUC的免疫抑制基质边界中的耦合**
CellChat分析揭示了SPP1⁺ TAMs与FAP⁺ myCAFs之间的显著通讯，通过TGFβ1–TGFBR1/2和SPP1–整合素等信号定义Niche1。空间分析显示这些配体-受体对在MI基底切片中具有更广泛的分布和边界共定位。mIF进一步证实了FAP⁺基质伴随SPP1⁺和FOXP3⁺信号围绕CK5/6⁺肿瘤上皮。NicheNet分析将SPP1列为巨噬细胞来源的主要配体，驱动FAP⁺ myCAFs的ECM组装和胶原重塑接收程序。在Niche1高表达的基质边界处，CD8-细胞毒性、细胞毒性T/NK和T细胞炎症评分从外非肿瘤侧向肿瘤侧递减，表明该边界具有免疫抑制特性。

**2.7 外部BCa数据支持SPP1相关的髓系-基质程序**
在多个外部BCa数据集中，SPP1⁺ TAM和FAP⁺ myCAF的共富集在基底高上皮区域更显著，其联合程序与炎症/细胞毒性和免疫/髓系抑制信号均相关，再现了基底UTUC的免疫活性但抑制性背景。

**2.8 UC模型中SPP1缺失的上皮细胞内在功能效应**
SPP1在恶性上皮细胞中表达高于癌旁。虚拟敲除后，GO和KEGG分析提示其参与增殖、迁移、ECM组织和粘附。siRNA敲低SPP1后，J82细胞活力、迁移和侵袭能力下降，且条件培养基减少HUVEC管形成。

**2.9 MI相关的VEGFA⁺ TAN–CXCR4⁺ tip EC血管生成程序**
CellChat鉴定出VEGFA⁺ TANs与CXCR4⁺ tip ECs之间的通讯，定义Niche2，涉及VEGFA–VEGFR1和NAMPT–INSR等配体-受体对。空间映射显示在MI基底切片中这两种细胞类型共定位更广泛，mIF证实了CD66b⁺VEGFA⁺中性粒细胞和CD31⁺CXCR4⁺ ECs在同一区域共存。

**2.10 Niche1在肿瘤边界富集伴随基底极化上皮并与不良预后相关**
多尺度空间分析显示，Niche1在MI基底切片中的丰度加权配对负担显著高于NMI，且在肿瘤边界呈现非随机共富集，而Niche2模式更异质。在22个MIBC切片中，Niche1负担沿基底-管腔轴增加。在日本-UTUC队列中，两个生态位均与肌层浸润相关，但仅Niche1在调整分期后仍与DSS相关。

**2.11 SPP1连接基底表型与UTUC不良预后**
SPP1和FAP均能追踪基底表型，联合分层可识别预后最差的SPP1高/FAP高组。SPP1在调整分期后仍与DSS相关（HR=1.17，p=0.036），且SPP1联合分期模型的5年AUC超过0.8，优于单独使用GATA3、KRT5或FAP。表型组范围孟德尔随机化未发现SPP1与广泛系统性疾病风险相关。

**总结讨论部分**
讨论强调，基底UTUC的免疫-基质富集背景主要独立于分期，而肌层浸润导致其空间重组为两个程序：Niche1（SPP1⁺ TAM–FAP⁺ myCAF边界程序）和Niche2（VEGFA⁺ TAN–CXCR4⁺ tip EC血管生成程序）。Niche1与结直肠癌和肺癌中报道的免疫排斥屏障类似，在MI基底UTUC中表现为ECM重塑和髓系免疫抑制的边界，且效应免疫评分向肿瘤侧递减。外部BCa数据支持该程序的保守性，并提示其与基底样肿瘤上皮的空间耦合。Niche2则类似于三阴性乳腺癌中的血管生成程序，但更具异质性，需在更大UTUC队列中验证。整体上，基底UTUC结合了免疫激活和抑制，免疫富集并不保证有效抗肿瘤免疫。SPP1连接了分子亚型、空间生态位重塑和临床结局，其预后价值值得进一步评估作为治疗靶点。

**研究结论**
基底UTUC具有一个很大程度上独立于分期的免疫-基质富集背景，而肌层浸润与其空间重组为两个程序相关：一个可重复的SPP1相关边界程序和一个更具异质性的血管生成程序。单细胞分辨率的空间图谱可更精确地解析这些程序，扩展到更大、多患者的UTUC队列将为模型训练和验证提供样本量。整合这些数据与深度学习等先进计算方法，可能区分跨患者重复出现的空间关系与患者特异性变异，并评估其治疗相关性。