基于液体活检的检测方法：利用硫酸肝素八糖在集成微流控系统中从血液和胆汁中检测循环中的以及脱落的胆管癌细胞

《Methods》：Liquid biopsy-based detection of circulating and exfoliated cholangiocarcinoma tumor cells from blood and bile using heparan sulfate octasaccharides on integrated microfluidic systems

　　

摘要

胆管癌（CCA）的早期诊断仍然具有挑战性，因为现有的诊断方法通常缺乏足够的敏感性来可靠地检测早期疾病。血液中的循环肿瘤细胞（CTCs）和胆汁中的脱落肿瘤细胞（ETCs）是基于液体活检检测的宝贵目标；然而，它们的低丰度和临床样本分析的复杂性给可靠富集和鉴定带来了实质性的技术挑战。在这里，我们提出了一种可重复的工作流程，使用合成细胞表面硫酸肝素（HS）八糖功能化的磁性珠子在集成微流控系统中从血液中分离和鉴定CCA肿瘤细胞，以及从胆汁中分离和鉴定ETCs。该方法结合了样本预处理、基于磁性珠子的富集、受控的低剪切混合和基于免疫荧光的鉴定，形成了一个适用于不同临床样本类型的统一工作流程。详细描述了关键的操作参数，包括磁性珠子浓度、混合频率和压力设置，以确保性能的一致性。使用这种工作流程，在临床相关的低丰度条件下，从胆汁中（针对ETCs）和血液中（针对CTCs）实现了大约70%的肿瘤细胞捕获率，每个样本的总处理时间为60-90分钟。该平台能够可靠地检测到每毫升血液或胆汁中仅一个肿瘤细胞。这种方法为糖胺聚糖介导的液体活检应用提供了一种实用且可适应的策略，并且可以扩展到涉及异质细胞表面相互作用的其他肿瘤细胞富集工作流程。

引言

细胞表面硫酸肝素（HS）糖通过其与多种病毒、细菌以及癌细胞的相互作用，在多种生物系统中发挥着重要作用。基于HS的糖探针和集成微流控系统（IMS）已被证明可以从胆汁和血液中高效分离和检测胆管癌（CCA）肿瘤细胞，应用范围从工程优化到临床验证[1]、[2]、[3]、[4]。然而，之前的研究主要集中在系统性能和分析可行性上，而不是开发一种标准化和集成的工作流程来跨不同的临床样本类型富集肿瘤细胞。在这里，我们提出了一种基于糖胺聚糖的液体活检方法，使用合成HS八糖功能化的磁性珠子在台式和IMS平台上从血液中富集和鉴定循环肿瘤细胞（CTCs），并从胆汁中富集和鉴定脱落肿瘤细胞（ETCs）。该工作流程包括样本预处理、基于糖胺聚糖的肿瘤细胞捕获以及受控低剪切条件下的免疫荧光鉴定。通过将标准化的流体处理与糖胺聚糖介导的富集相结合，本研究方法支持在不同类型的血液和胆汁样本中一致地检测肿瘤细胞，并为临床液体活检应用提供了一个实用的平台。

CCA是一种胆道恶性肿瘤，可以起源于肝内或肝外胆管[5]。尽管成像和病理学评估取得了进展，但早期诊断仍然具有挑战性，许多患者在诊断时已经患有晚期疾病，导致临床结果不佳[6]。当前的诊断方法包括血清生物标志物如碳水化合物抗原19-9（CA19-9）和癌胚抗原（CEA）、放射成像和组织样本的病理学检查[6]、[7]、[8]、[9]。然而，这些方法可能会受到灵敏度不足、缺乏疾病特异性或难以检测小而异质性病变的限制[7]、[8]、[9]、[10]。因此，人们非常感兴趣于开发能够改善肿瘤检测和表征的微创液体活检策略。

CTCs可以从实体肿瘤扩散到血液中，导致转移[11]。CTCs膜上表达有被广泛研究的生物标志物，为诊断探针提供了分子靶点[12]、[13]。然而，临床样本中CTCs的数量很少，这阻碍了有效检测。除了基于血液的CTCs外，胆汁中的ETCs也可以用于诊断CCA，因为它们靠近肿瘤病变（其细胞会定期脱落进入胆管上皮）。胆汁可以通过内镜逆行胆道引流或经皮经肝胆道引流获得[14]。相比之下，CCA细胞通常只有在肿瘤细胞进入系统循环后才能在血液中被检测到，这限制了基于CTCs的方法（如CellSearch?）在早期疾病诊断中的灵敏度[15]。

结合血液来源的CTCs和胆汁来源的ETCs的特性，可以设计出一种全面的CCA检测方法，用于监测不同疾病阶段的肿瘤细胞浓度。肿瘤进展涉及增殖、侵袭、转移和血管生成，糖在调节这些过程中起作用[16]、[17]、[18]。事实上，据报道不同的糖能够识别并与肿瘤细胞膜上的某些抗原相互作用，从而影响肿瘤细胞信号传导。例如，β-葡聚糖受体dectin-1可以识别癌细胞膜上的糖[19]。因此，糖可能是检测癌细胞的优秀候选物。肝素和HS是哺乳动物细胞外基质中丰富的O-和N-硫酸化糖胺聚糖（GAGs），它们与核心蛋白质共价结合形成蛋白聚糖[20]、[21]。{Esko, 2002 #788}由于结构多样性，HS参与调节多种生理过程，如血液凝固、肿瘤细胞增殖、血管生成、转移以及细菌和病毒感染[22]、[23]、[24]。HS通过其糖胺聚糖链与多种细胞成分相互作用[25]，HS蛋白聚糖可以结合大量的蛋白质，包括成纤维细胞生长因子家族成员和细胞因子[26]、[27]。然而，GAGs在细胞表面的普遍存在但异质性使得它们不适合作为结构-活性关系的研究候选物

人们已经投入了大量努力来合成针对特定HS结合蛋白的HS寡糖[25]。在许多情况下，只有通过涉及糖基转移酶、C₅-异构酶和硫酸转移酶的酶促方法才能获得定义的HS寡糖[26]、[27]，尽管这些酶仍存在一些限制。化学合成有可能提供足够量的规则和不规则的HS寡糖，这些寡糖的长度超过六个糖残基，由二糖构建块组成[28]。在本方法中，生物素化的、高度硫酸化的多阴离子HS八糖（包括SCH-45、SCH-46和SCH-64）被固定在磁性珠子上（MB-SCH-45、-46和-64），以在标准化的工作流程中从血液样本中捕获CCA CTCs和从胆汁中捕获ETCs。三种代表性的生物素化HS八糖的化学结构显示在补充表1中。

部分片段

细胞培养和临床样本

细胞培养的试剂和程序在补充方法中有描述。CCA细胞系SNU478、HuCCT1、Huh28、KKU100分别来源于Vater壶腹、肝内转移腹水、肝内胆管和与肝吸虫相关的肝门胆管，在Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI-1640；Thermo-Fisher Scientific [TFS]）或Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM；TFS）中培养，其中添加了胎牛血清（Gibco）和

选择用于CCA肿瘤细胞富集的HS八糖

为了识别用于CCA肿瘤细胞富集的HS八糖，使用多种不同组织来源的癌细胞系评估了27种生物素化的合成HS八糖。根据初步的亲和力评估，选择了100 μM的涂层浓度用于所有HS八糖包覆的磁性珠子，并在整个后续实验中保持一致使用。评估了HS八糖包覆的磁性珠子的肿瘤细胞捕获能力

讨论

本研究提出了一种基于糖胺聚糖的微流控方法，用于从血液和胆汁样本中富集和鉴定CCA肿瘤细胞。传统的依赖EpCAM的方法[33]、[34]在具有异质性或低EpCAM表达的肿瘤中可能表现不佳，特别是在与上皮-间质转化相关的条件下[35]。相比之下，本策略利用合成HS八糖作为亲和配体

结论

本研究提出了一种标准化的基于HS八糖的液体活检工作流程，用于从血液和胆汁样本中富集和鉴定CCA肿瘤细胞。该协议结合了台式和微流控平台，并证明了SCH-46和SCH-64在血液和胆汁来源样本中的适用性，同时使用SCH-45作为基准探针。该工作流程为可重复的基于糖的肿瘤细胞富集提供了一个实用框架，并可能有助于

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢1）台湾国家科学技术委员会（NSTC）（NSTC 112-2221-E-007-017-MY3、NSTC 113-2221-E-007-144-MY3、NSTC 114-2221-E-007-009-MY3、NSTC 112-2639-M-001-001-ASP、NSTC 113-2639-M-001-001-ASP MOST112-2321-B-006 -023 - 和 NSTC 114-2639-M-001-001-ASP）对本工作的资助。

作者贡献

S.C.H.、Y.S.S.和G.B.L.设计了实验并进行了监督。N.J.C.、C.J.H.和Y.S.S.收集和准备了临床样本并申请了研究委员会批准

蔡伟春|安纳达拉朱·班达鲁|张成秀|普里亚·戈皮纳森|王志洪|蔡毅成|黄建俊|蒋奈荣|黄玉洁|单彦申|洪尚成|李国斌

台湾新竹国立清华大学动力机械工程系