: Creb3l1过表达改善老年大鼠屈肌腱修复

《Aging Cell》：Creb3l1 Overexpression Improves Flexor Tendon Repair in Aged Rats

　　

衰老会增加肌腱损伤的发生率并导致修复不良结局，但肌腱力学特性的年龄相关差异及其潜在机制仍不清楚。研究人员首先分析了全球疾病负担（GBD）数据库的数据，以表征衰老与人群水平肌腱损伤负担变化之间的关联。研究发现，由机械力导致的肌腱损伤的年龄标准化发生率（ASIR）随年龄增长而下降，而年龄标准化患病率（ASPR）随年龄增长而上升，且因肌腱损伤导致的伤残损失寿命年（YLDs）也随年龄增长呈现增加趋势。在这些流行病学观察结果的指导下，研究人员进一步使用老年大鼠趾长屈肌（FDL）腱损伤模型进行了离体生物力学评估，以在组织水平验证与年龄相关的力学退化，揭示了老年雌性大鼠肌腱的力学特性显著受损。为了揭示这种年龄依赖性力学退化背后的分子驱动因素，研究人员对肌腱组织进行了单细胞RNA测序，并发现Col1a₁和Sparc在老年肌腱中表达下调。根据JASPAR网站预测，转录因子Creb3l1能同时结合Col1a₁和Sparc基因的启动子区域，并且其过表达促进了它们的表达。最后，体内Creb3l1过表达上调了Col1a₁和Sparc蛋白的水平，并改善了老年肌腱的滑动功能、愈合强度和弹性模量，尤其是在老年雄性大鼠中。综上所述，本研究将基于人群的流行病学证据与临床前功能及机制验证相结合，为年龄相关肌腱损伤的风险预测和新型治疗靶点提供了见解。

研究背景与意义
随着人口老龄化，老年群体肌腱损伤发病率居高不下，且修复效果较差。既往基于小鼠模型的研究表明，衰老会损害屈肌腱的机械适应性、应力反应性和愈合能力，但年龄相关的肌腱力学特性退化及其潜在的生物学机制至今尚不明确。为阐明衰老引起肌腱功能减弱的原因，研究人员结合流行病学与动物实验，利用单细胞RNA测序揭示衰老改变肌腱力学特性的细胞层面机制，并探究通过调节差异基因改善老年损伤肌腱修复结局的可行性。该研究将基于人群的流行病学证据与临床前功能和机制验证相结合，为年龄相关肌腱损伤的风险预测和新型治疗靶点提供了深刻见解。研究成果发表在《Aging Cell》杂志上。

关键技术方法
研究人员主要采用以下关键技术方法：首先，从全球疾病负担（GBD）数据库提取机械力暴露导致肌腱损伤的流行病学数据，应用年龄-时期-队列（APC）模型分析其流行趋势。其次，选取8周龄与18月龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠构建动物模型，利用拉伸测试机进行离体生物力学测量。接着，对年轻与老年大鼠肌腱组织开展单细胞RNA测序。通过JASPAR数据库预测与分子对接验证转录因子结合位点，采用双荧光素酶报告基因实验确认靶向调控关系。最后，通过慢病毒介导体内外基因过表达，结合组织学与免疫荧光评估修复效果。

时间及年龄相关的肌腱损伤趋势
通过分析GBD数据库，发现机械力导致的肌腱损伤发生率随年龄增长呈下降趋势，但患病率和伤残损失寿命年随年龄显著上升，表现出明显的老龄化趋势，并存在性别差异。

机械力致肌腱损伤的空间分布及社会人口学差异
基于全球区域数据分析，发现肌腱损伤负担与社会人口学指数（SDI）呈倒“V”型关系，当SDI低于0.75时，疾病负担逐渐上升；超过0.75后开始下降。国家SDI越高，疾病负担越低。

年龄相关的力学特性差异
通过对大鼠趾长屈肌（FDL）腱进行离体拉伸测试，发现随年龄增长，雌性大鼠肌腱的2 mm间隙形成力、最大拉力和弹性模量显著下降；而雄性大鼠仅最大抗拉力显著增加，且与其肌腱重量增加密切相关。

肌腱细胞的单细胞测序分析
通过单细胞转录组测序分析，发现Col1a₁和Sparc基因在老年大鼠肌腱组织多种细胞类型中显著下调，尤其在成纤维细胞中下调明显，并伴随胶原纤维合成功能的严重退化。

细胞通讯与胶原纤维分析
通过CellChat分析发现，随年龄增长，成纤维细胞与免疫细胞间的互作权重整体增加，而与内皮细胞等细胞的互作减弱。H&E和Masson染色及透射电镜观察显示，老年大鼠肌腱组织内胶原纤维稀疏、排列紊乱、长度缩短，且纤维间出现间隙。

转录因子Creb3l1调控Col1a1和Sparc
通过测序结果进行转录因子差异分析及JASPAR数据库预测，发现转录因子Creb3l1在老年肌腱中表达下调。分子对接和双荧光素酶报告基因实验证实，Creb3l1可直接结合并激活Col1a₁和Sparc启动子。体外转染慢病毒过表达Creb3l1后，Col1a₁和Sparc的mRNA及蛋白水平均显著上调。

Creb3l1过表达促进老年大鼠肌腱修复
通过建立大鼠肌腱损伤模型并局部注射过表达慢病毒，发现Creb3l1过表达显著改善了老年大鼠肌腱的滑动功能，尤其在老年雄性大鼠中，其愈合强度和弹性模量获得显著提升。

Creb3l1对细胞衰老及巨噬细胞极化的影响
在体外实验中，利用siRNA敲低Creb3l1发现其缺失会下调Col1a₁和Sparc表达，并促进肌腱细胞衰老。在体内修复模型中，Creb3l1过表达组中CD206阳性的M2巨噬细胞数量增加，表明其可能通过改善局部免疫微环境促进组织修复。

讨论与结论
通过从流行病学趋势到动物模型的综合研究，研究人员证实年龄增长导致肌腱部分生物力学特性逐渐减弱。单细胞测序揭示了与胶原产生密切相关的Col1a₁和Sparc基因在老年肌腱中显著下调，伴随胶原纤维形态稀疏；而转录因子Creb3l1的表达下降可能是导致Col1a₁和Sparc转录减少的原因，过表达Creb3l1可改善老年大鼠肌腱的修复效果。由于雌性大鼠可能受雌激素水平对胶原交联酶（如LOX）活性的抑制，其力学增强效果不及雄性。尽管动物实验存在局限于实验室场景的局限性，但流行病学分析与动物实验的结果部分为预测不同年龄和性别发生机械力致肌腱损伤的概率及良好恢复的概率提供了一定参考。研究结论表明，衰老通过抑制Creb3l1转录进而下调Col1a₁和Sparc表达，最终引起肌腱力学退化，而靶向过表达Creb3l1有望成为治疗年龄相关肌腱损伤的新策略。