《Nature Cell Biology》：DREAMS illuminates spatial DNA and RNA modification landscapes
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DNA和RNA修饰调控基因表达与RNA加工过程，但它们在复杂组织中的空间组织模式仍然难以捉摸。研究人员开发了DNA RNA Elements Areal Mass Spectrometry（DREAMS），这是一种质谱成像平台，能够同时空间映射多种核酸修饰。将
DNA和RNA修饰调控基因表达与RNA加工过程，但它们在复杂组织中的空间组织模式仍然难以捉摸。研究人员开发了DNA RNA Elements Areal Mass Spectrometry（DREAMS），这是一种质谱成像平台，能够同时空间映射多种核酸修饰。将DREAMS应用于TET缺陷小鼠大脑（Tet1Δ/Δ和三元Tet1/2/3Δ/Δ），研究人员发现了TET1在调节N1-甲基腺苷（m1A）这一关键RNA修饰中的意外作用。虽然DREAMS揭示了TET基因敲除中改变的广泛修饰景观，但研究人员确定了TET1介导的m1A变化与转录组改变相关。该研究确立了DREAMS作为空间表观基因组学/表观转录组学的变革性工具，并提示TET酶可能影响多种DNA和RNA修饰，在核酸调控中具有潜在的关卡作用。
**DREAMS技术照亮DNA与RNA修饰的空间图谱：TET1调控N1-甲基腺苷的新机制**
**研究背景与科学问题**
DNA和RNA是编码遗传信息的基础分子，其上的化学修饰由特定酶催化，直接影响转录和降解等关键生物学过程。过去的研究主要聚焦于DNA甲基化，特别是脱氧胞苷（dC）甲基化作为基因表达调控因子的作用。然而，对其他修饰的研究，尤其是它们在复杂组织中的空间组织模式，仍然十分有限。RNA修饰种类繁多，在信使RNA、转运RNA、核糖体RNA和非编码RNA中存在超过170种不同的修饰类型。理解这些DNA/RNA修饰的空间模式，即使不解析精确的分子背景，对于识别功能性表观遗传和表观转录组热点区域至关重要。针对单一修饰或离散区域的研究可能遗漏这些更广泛的调控景观。高通量测序技术能够实现选定修饰的全基因组和全转录组分析，但该方法是间接的且易受偏差影响。相比之下，液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）能够直接鉴定和定量修饰核苷，并可检测丰度较高和较低或此前未知的修饰。然而，传统LC–MS/MS工作流程依赖批量提取和酶消化，劳动强度大、材料消耗高，且不适合在脑等器官中进行空间分辨的多修饰分析。因此，开发一种能够空间可视化多种核酸修饰的新方法，对于系统理解这些修饰在组织中的分布及功能意义至关重要。
**研究内容与结论**
针对上述问题，研究人员开发了DREAMS（DNA RNA Elements Areal Mass Spectrometry），这是一种基于气流辅助解吸电喷雾电离（AFADESI）的质谱成像（MSI）平台，能够在不破坏组织空间结构的前提下，同时检测组织中多种游离修饰核酸代谢物。研究人员首先通过稳定同位素示踪实验证实了游离修饰核酸与DNA/RNA结合的修饰之间存在代谢偶联；随后利用LC–MS/MS对小鼠大脑总DNA/RNA进行分析，揭示了大脑中丰富的修饰谱系。将DREAMS应用于TET缺陷小鼠模型，研究人员发现TET1在调节N1-甲基腺苷（m1A）这一关键RNA修饰中发挥着此前未知的作用。通过体外酶活实验、细胞水平敲低与回补实验以及m1A RNA免疫沉淀测序（m1A RIP-seq），研究人员证实TET1能够特异性调节较大RNA种类（如mRNA）上的m1A水平，而对tRNA富集组分无显著影响。该研究确立了DREAMS作为空间表观基因组学/表观转录组学变革性工具的地位，并提示TET酶可能影响多种DNA和RNA修饰，在核酸调控中具有潜在的关卡作用。论文发表在《Nature Cell Biology》。
**主要技术方法**
研究人员使用了以下几种关键技术方法：（1）开发并优化了DREAMS质谱成像平台，实现对组织中游离核酸代谢物的空间可视化；（2）采用稳定同位素示踪技术验证游离与结合态修饰核酸的代谢偶联；（3）运用LC–MS/MS对DNA/RNA结合态及游离态核酸修饰进行精确定量；（4）通过体外重组酶活实验和细胞敲低/回补实验验证TET1对m1A的直接调控作用；（5）利用m1A RIP-seq（m1A RNA免疫沉淀测序）在转录组水平鉴定TET1调控的m1A修饰位点。样本来源为C57BL/6J小鼠（野生型及Tet1fl/fl、Tet1/2/3fl/fl条件性基因敲除小鼠，由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所徐国良教授提供）和HEK293T细胞系。
**研究结果**
**游离修饰核酸与DNA/RNA结合修饰的偶联验证**
研究人员通过稳定同位素示踪实验，将HEK293T细胞在含有同位素标记甲硫氨酸（Met-13C,d3）的培养基中培养7天，发现标记可同时掺入DNA/RNA结合态和游离态的5-甲基脱氧胞苷（m5dC）、5-甲基胞苷（m5C）和m1A中，证实了游离修饰核酸与结合态修饰之间的直接代谢偶联。LC–MS/MS分析小鼠大脑总DNA/RNA揭示了一个丰富的修饰谱系，包括高丰度的m5dC、m5C、m1A，以及低丰度的N6-甲基-2'-脱氧腺苷（m6dA）和损伤标志物脱氧肌苷（dI）。
**DREAMS实现核酸代谢物的空间可视化**
DREAMS在野生型小鼠脑切片上成功检测到神经递质等生物分子的区域分布差异，与已知代谢物图谱一致；能区分质量差仅为0.0085 Da的代谢物异构体（如 sciadonic acid 和胍丁胺）；通过加标实验验证了对多种核酸代谢物的高灵敏度、高选择性和高回收率检测。研究还发现，虽然RNA修饰的脱氨基率较低，但dI:dA的转化率较高，因此dI的检测结果需谨慎解读；此外，DREAMS无法区分某些质量相同的异构体（如腺苷A和2'-脱氧鸟苷dG），需借助LC–MS/MS进行补充分析。
**DREAMS验证已知TET表型**
研究人员通过AAV-Cre-EGFP视网膜后注射在Tet1fl/fl和Tet1/2/3fl/fl小鼠中诱导基因敲除，获得Tet1Δ/Δ和Tet1/2/3Δ/Δ小鼠。LC–MS/MS分析显示，TET1单敲除仅引起微妙的胞嘧啶修饰变化（hm5dC达到统计学显著），而三敲除则表现出m5dC显著升高和hm5dC显著降低，与TET酶之间的部分功能冗余一致。DREAMS检测到Tet1Δ/Δ小鼠几乎所有脑区（除前嗅核AON外）的胞苷代谢物+hm5dC（mC+hm5dC）信号增加，与LC–MS/MS检测到的DNA/RNA结合态修饰变化一致；游离m5C在皮层中的增加也验证了DREAMS信号与RNA结合态m5C变化的相关性。
**DREAMS揭示TET1下游未知靶点**
DREAMS系统分析发现，TET1缺失导致多种核酸修饰的脑区特异性变化，包括肌苷（I）和未修饰胞苷（C）在超过半数脑区的增加，以及N2,N2-二甲基鸟苷（m22G）、N6,2'-O-二甲基腺苷（m6Am）、甲基化尿苷代谢物（mU）和游离m6dA的改变。甲基化腺苷代谢物（mA，包括m6A、m1A和Am异构体）在 cerebellum（Cb）和尾壳核（CPu）中表现出最显著的变化，与mC+hm5dC的广泛变化形成对比，揭示了TET1缺失的精细脑区特异性效应。
**DREAMS检测到mA区域特异变化并锁定m1A**
LC–MS/MS分析显示，在mA异构体中，m1A在全脑RNA中表现出最显著的变化；m1A已知调控因子（TRMT6/TRMT61A、TRMT10C、ALKBH1、ALKBH3和FTO）的表达无显著基因型差异，提示TET1本身而非经典m1A调控因子的表达变化参与了m1A表型。区域LC–MS/MS分析证实CPu中RNA结合态m1A降低，与DREAMS结果一致；游离m1A在CPu中的定量也验证了DREAMS检测到的变化。
**TET1调控大RNA种类中的m1A**
研究人员将总RNA分为tRNA富集的小RNA（<200 nt）和tRNA缺失的大RNA（>200 nt）组分。对照标志物m5U和m7G在<200 nt组分中的富集确认了分离成功。LC–MS/MS分析显示，m1A在<200 nt组分中丰度极高，而Tet1Δ/Δ小鼠>200 nt组分的m1A显著增加，<200 nt组分无显著变化；RT–qPCR分析排除了tRNA丰度的系统性变化，表明观察到的差异反映修饰变化而非丰度改变。这表明TET1在体内特异性调控大RNA种类中的m1A，而非tRNA富集组分。
**TET1作用于m1A的体外和细胞实验证据**
体外重组实验表明，TET1催化结构域能降低总RNA和>200 nt RNA中的m1A水平，但对<200 nt tRNA富集组分无显著效应，其效果与ALKBH3相当；TET抑制剂IOX1能显著抑制TET1介导的m1A降低，表明该效应依赖催化活性。使用纯化的TET1催化结构域（TET1CD）和催化受损突变体（TET1YxA，HxD基序突变）进行的实验显示，TET1YxA保留了降低m1A的能力但丧失了m5C氧化活性，表明TET1对腺苷与胞嘧啶修饰具有机制上不同的处理方式。动力学分析测得TET1对m1A的Kcat为4.26×10?? s?1，Km为12.8 μM。细胞实验证实，在TET1敲低的HEK293T细胞中回补TET1CD可降低m5C/m5dC和m1A水平并升高hm5C/hm5dC，而回补TET1YxA则仅保留降低m1A的能力。
**TET1调控CPu转录组中的m1A mRNA**
m1A RIP-seq分析显示，Tet1Δ/Δ小鼠CPu中存在特有的高置信m1A峰；两种基因型均表现出m1A在5'UTR转录起始位点附近的经典富集模式。m1A增加的转录本显著富集于突触组织和轴突再生的Gene Ontology（GO）条目。整合分析揭示了与m1A变化一致的广泛转录组失调；腺苷受体ADORA2A和神经肽PENK同时表现出m1A状态改变和转录本丰度变化。Jun基因（即早基因，神经元激活时快速诱导）在Tet1Δ/Δ小鼠中表现出最显著的统计学上调并伴随m1A高甲基化，而Gadd45b（活性诱导的DNA去甲基化关键因子）表现出强显著的转录上调但无可检测的m1A变化，提示TET1可能协调快速的转录本特异性表观转录组调控（Jun）与持续的DNA去甲基化程序（Gadd45b）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，DREAMS作为一个灵敏、多重的平台，能够在完整组织中可视化游离核苷库，同时报告多种DNA和RNA修饰通路及代谢组信息，特别适合作为发现工具来识别空间"热点"并缩小候选范围以供后续靶向验证。该技术也存在一些重要局限性：它测量总游离修饰核苷，无法解析单个RNA类别的贡献；无法区分具有相同质荷比的异构体修饰（如A和dG、mC+hm5dC和mA）；对低丰度修饰（如脑中的游离m5dC）可能接近检测限；dI测量易受脱氨基人工产物干扰；时间分辨率有限。体外和体内数据共同表明TET1与m1A水平的关联与非经典生化活性相容，但明确的机制解析仍需更广泛的动力学、结构和底物范围分析。研究人员强调，m1A RIP-seq检测到的mRNA中m1A变化是否直接源于TET1对这些转录本的直接作用尚不能正式得出结论，且体内分析基于包含多种细胞类型的bulk组织测量，观察到的变化尚不能明确归因于特定细胞群体。研究结论部分总结道：研究人员开发了DREAMS作为一种空间分辨的DNA和RNA修饰体内复杂图谱切入点；TET1研究 exemplifies 了如何将基于代谢物的图谱与生化和测序方法整合，揭示表观遗传-表观转录组调控的新维度。随着技术和概念上的空白被填补，DREAMS引导的分析将有助于识别修饰"热点"并阐明它们在健康和疾病中的贡献。
