《Neurobiology of Disease》：Splicing modulation of ATXN2 as a therapeutic strategy to regulate Ataxin-2 protein levels in ALS
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ATXN2与肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）的风险增加相关，而ATXN2的下调已被证明可缓解ALS模型中的TDP-43蛋白病（TDP-43 proteinopathy）。在研究中，研究人员证明，在rNLS
ATXN2与肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）的风险增加相关，而ATXN2的下调已被证明可缓解ALS模型中的TDP-43蛋白病（TDP-43 proteinopathy）。在研究中，研究人员证明，在rNLS8小鼠中，停用多西环素后Ataxin-2蛋白水平上调，这与TDP-43过表达、磷酸化和聚集同时发生。为了降低Ataxin-2蛋白水平，研究人员探索了RNA水平上的剪接调控（splicing modulation）策略。通过生物信息学分析，研究人员鉴定了ATXN2内含子8中的一个替代性5'剪接位点。该替代剪接导致外显子8后3'端额外增添47个碱基对。额外核苷酸的插入引起移码突变，导致mRNA产量减少，进而降低蛋白水平。发现该替代剪接位点后，研究人员进行了反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）微步移（micro-walk）筛选，以靶向该区域的ASO。研究人员鉴定了能特异性调控该剪接的ASO，包括增强或抑制替代剪接的ASO。研究人员验证了促进替代剪接并减少组成型剪接的ASO能降低Ataxin-2蛋白水平，进而在TDP-43毒性细胞模型中减少TDP-43聚集和应激颗粒形成。此外，研究人员确认，通过先前验证的ASO递送降低Ataxin-2水平可改善rNLS8小鼠的TDP-43病理。ATXN2替代剪接的发现，以及在人细胞系检测中使用ASO进行剪接调控的确认，为通过调节Ataxin-2蛋白水平治疗ALS提供了原理验证策略的证据。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种以运动神经元进行性丢失为特征的致死性神经退行性疾病，目前缺乏有效治愈手段。其病理标志之一是TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）从细胞核异常移位至细胞质，形成聚集并发生磷酸化。研究表明，Ataxin-2是TDP-43病理的强效修饰因子，其下调可减轻ALS模型中的TDP-43蛋白病。然而，目前尚缺乏有效降低Ataxin-2蛋白水平的治疗策略。本研究旨在通过RNA剪接调控降低Ataxin-2水平，探索治疗ALS的新途径。
研究人员首先在rNLS8小鼠模型中证实，停用多西环素诱导人TDP-43（hTDP-43ΔNLS）表达后，脑内Ataxin-2蛋白水平随TDP-43病理的出现而显著上调。随后通过生物信息学分析，在ATXN2内含子8中鉴定出一个替代5'剪接位点，该位点的使用会引入47个额外碱基对，导致移码突变并预测触发无义介导的mRNA降解。在此基础上，研究人员设计并筛选了靶向外显子8-内含子8-外显子9区域的ASO微步移文库，鉴定出能调节ATXN2剪接的ASO，其中ASO 8-2可显著降低Ataxin-2蛋白水平。
主要关键技术方法：采用生物信息学（GTEx Portal、UCSC Genome Browser）鉴定替代剪接位点；通过ASO微步移和qRT-PCR筛选活性ASO；使用A549细胞、iPSC来源神经元及ΔNLS-SHSY5Y细胞进行体外剪接检测和功能验证；利用rNLS8小鼠进行体内ASO药效学研究。样本来源：rNLS8小鼠由Jackson Laboratory维持；A549细胞购自ATCC；ΔNLS-SHSY5Y细胞由ThermoFisher构建。主要检测技术包括RT-PCR、Sanger测序、qRT-PCR、Western blot、AlphaLISA、高内涵成像、免疫细胞化学及脑室内注射等。
研究结果如下：
Ataxin-2在rNLS8小鼠中随TDP-43病理上调：通过Western blot检测发现，停用多西环素后1-2周，rNLS8小鼠脑中Ataxin-2蛋白水平较对照组增加约50%，同时伴随TDP-43聚集和磷酸化水平升高。
ATXN2存在预测被无义介导降解的替代剪接形式：通过GTEx Portal和UCSC Genome Browser分析，发现ATXN2内含子8存在一个替代5'剪接位点，使外显子8后增加47个碱基对，导致移码和提前终止密码子。RT-PCR和Sanger测序确认该替代剪接在iPSC来源神经元及A549细胞中存在。
鉴定出可调节剪接并降低ATXN2表达的ASO：通过ASO微步移和qRT-PCR筛选，发现ASO 3和ASO 8-2能减少组成型剪接、增加替代剪接，并显著降低ATXN2 mRNA和Ataxin-2蛋白水平；而ASO 14则增强组成型剪接，蛋白水平升高。
ASO 8-2在TDP-43毒性细胞模型中调节剪接并改善病理：在ΔNLS-SHSY5Y细胞中，ASO 8-2使替代剪接增加2倍以上，组成型剪接降低60%，Ataxin-2蛋白减少约80%，并显著降低亚砷酸钠应激诱导的TDP-43聚集。
ASO 8-2可减轻TDP-43磷酸化并挽救细胞存活：高内涵成像显示，应激条件下ASO 8-2显著减少Ataxin-2斑点面积、降低磷酸化TDP-43水平，并增加MAP2阳性细胞数量，表明Ataxin-2敲低具有神经保护作用。
ASO 8-2可减轻应激颗粒和TDP-43病理：ASO 8-2处理减少G3BP阳性应激颗粒数量，同时降低胞质和胞核中FLAG标记TDP-43的荧光强度，提示Ataxin-2敲低可改善TDP-43错定位和病理状态。
体内敲低ATXN2可减轻rNLS8小鼠TDP-43病理：经脑室内注射已发表的ASO-B后，rNLS8小鼠脑内ATXN2 mRNA下降约30%，Ataxin-2蛋白下降约40%，并显著减少聚集TDP-43、25 kDa C末端片段（CTF-25）及RIPA不溶性磷酸化TDP-43，但总TDP-43水平保持不变。
讨论部分指出，ASO疗法在ALS治疗中展现出临床潜力，例如靶向SOD1的tofersen已被美国FDA批准。与ASO和基因治疗相比，小分子剪接调节剂可能具有更好的口服生物利用度和脑渗透性，是未来的潜在策略。本研究结果与既往报道一致，即降低Ataxin-2不影响总TDP-43水平，但可减少病理形式的TDP-43。rNLS8模型表型快速且严重，可能限制行为学改善的检测，未来可使用更慢进展的模型，并优化ASO递送以实现更充分的脊髓覆盖。
总之，本研究通过生物信息学分析和ASO微步移鉴定了可调节ATXN2剪接的ASO，并在ΔNLS-SHSY5Y细胞中证明剪接调节ASO可降低Ataxin-2蛋白水平并改善TDP-43病理。研究人员还验证了在rNLS8小鼠中通过既定ASO降低Ataxin-2水平可减少TDP-43病理形式。这些数据确立了ATXN2剪接调节作为人细胞模型中的原理验证策略，并为未来优化和在体验证该剪接调节方法提供了依据。
