《MicrobiologyOpen》：Unlocking the Bioactive Potential of Streptomyces: A Multidisciplinary Approach to Strain Improvement
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链霉菌是一属革兰氏阳性细菌，因其产生多种次级代谢产物的卓越能力而闻名，其中许多代谢产物具有显著的药用和农业价值。在寻找新疗法和应对抗生素耐药性及粮食安全等全球挑战的可持续解决方案的过程中，释放链霉菌的全部生物活性潜力变得日益重要。本综述论文旨在弥合文献中的空白
链霉菌是一属革兰氏阳性细菌，因其产生多种次级代谢产物的卓越能力而闻名，其中许多代谢产物具有显著的药用和农业价值。在寻找新疗法和应对抗生素耐药性及粮食安全等全球挑战的可持续解决方案的过程中，释放链霉菌的全部生物活性潜力变得日益重要。本综述论文旨在弥合文献中的空白，全面、综合地概述链霉菌菌株改良的最新进展。研究人员探讨了通过多学科方法优化链霉菌中次级代谢产物的生产。文章还强调了传统方法与现代遗传和代谢工程技术的整合，以改良生物合成途径，以及用于菌株开发、系统和发酵的适应性实验室进化，旨在最大化有价值生物活性化合物的生产。虽然以往的研究探讨了菌株优化的各个独立方面，但本综述提出了一个关于如何有效应用这些策略的统一视角。本综述不仅增强了对链霉菌生物活性潜力的理解，还满足了对一个整体框架的需求，该框架在菌株改良中既考虑了既定技术又考虑了新兴技术。通过填补这些空白，本综述有助于更完整地理解如何优化链霉菌以生产有价值的生物活性化合物，从而指导生物技术和制药领域的未来创新与应用。
1 引言
微生物是生物活性化合物的天然生产者，这些次级代谢产物在医药、农业和畜牧业中发挥重要作用。在所有微生物中，放线菌在生物活性化合物的合成中占主导地位。链霉菌是放线菌科的一员，是一类具有70%或更高GC含量的革兰氏阳性、丝状土壤腐生菌。目前，StreptomeDB 4.0包含来自约3900种链霉菌的8500多种天然产物。近70%的临床抗生素及其他药物来源于链霉菌。为了满足市场需求，对链霉菌物种进行工程化改造以大规模生产具有重要商业价值的工业代谢产物变得不可或缺。因此，链霉菌的生物合成途径一直是菌株改良、代谢工程和生物工程的关键焦点。全基因组测序和基因组挖掘研究表明，链霉菌基因组含有大量生物合成基因簇，其中许多在实验室条件下保持转录沉默或表达不佳。每个链霉菌次级代谢产物通常由20到30个基因组成的广泛BGCs编码，可达100 kb。目前对放线菌的分离采样仅占地球表面的一小部分，各种宏基因组学研究表明，用于次级代谢产物生产的新型聚酮和非核糖体肽途径仍有待探索。因此，迫切需要激活沉默BGCs并增强菌株性能，以促进产品开发和商业化。
2 链霉菌的次级代谢——调节级联
次级代谢产物的生产通常与链霉菌的生长周期有关，特别是从营养状态到孢子形成阶段的转变。次级代谢产物的合成通常在生长的迟缓指数期后期或稳定期早期开始。抗生素的生物合成与形态分化密切相关，通常在培养物从活跃生长过渡到营养受限条件时被激活。营养状况，特别是磷酸盐、氮和碳的可用性，是次级代谢的主要决定因素。发育调节因子控制从营养生长到孢子形成的转变。次级代谢产物的生产由包含环境信号感知系统、全局调节因子、簇座调节因子和反馈控制机制的分层调节级联控制。链霉菌激素/信号首先结合到其各自的受体并触发一系列次级代谢产物生产途径，如γ-丁内酯和丁烯内酯激素。其次，全局调节因子以多种方式影响较低的调节水平，通过双组分系统检测胞外信号。特定的TCS如PhoP/PhoR控制抗生素生产和形态分化。DasR、AdpA、BldD、Wb1A和AtrA等调节因子也参与调节次级代谢。途径特异性调节因子通常与BGCs相关并控制特定代谢途径基因的转录，被称为CSRs。最后，反馈调节由代谢物生产和运输协调，代谢物在细胞内的浓度和运输调节次级代谢。
3 链霉菌菌株改良的关键方法
合成生物学的出现扩展了途径工程、基因组编辑和激活隐性BGCs的分子工具。近期进展包括基于成簇的规律间隔短回文重复序列的系统、启动子工程和异源表达平台，这些加强了旨在增强代谢物生产的菌株改良策略。
3.1 经典菌株改良
3.1.1 化学和物理诱变
诱变是开发高效次级代谢产物合成菌株的首个稳健方法。分为使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍、甲基磺酸乙酯或亚硝酸的化学诱变，以及使用紫外线或X射线的物理诱变。诱变如MNNG和EMS会导致GC到AT的转换突变以及所有四种颠换。研究表明，类似于大肠杆菌，链霉菌也具有通过无错和易错DNA修复途径响应MNNG的适应机制。通过物理和化学诱变可以提高阿维菌素B1b和雷帕霉素等次级代谢产物的产量。全基因组测序使得能够对野生型菌株和选定的突变体进行比较研究，以增加次级代谢产物的产量。
3.1.2 转座子诱变
基于转座子的诱变在增强次级代谢产物生产方面取得了多项进展。通过改进转座子递送系统，如IS204转座子，可以在天蓝色链霉菌中建立具有随机插入的突变体文库。高活性Tn5转转座酶系统和小型Tn5系统的建立，鉴定出影响放线紫红素生产的基因。基于Himar1的合成转座子系统和移动II型内含子的基因编辑工具也为全基因组诱变提供了强大的工具，能够发现调节次级代谢产物生产的关键基因和途径。
3.1.3 高产突变体的筛选
3.1.3.1 抗生素抗性选择
选择抗生素抗性是一种直接、快速且具有成本效益的方法。该方法可以检测广谱的自发突变，包括碱基对替换、缺失和插入，避免了化学诱导突变带来的复杂问题。
3.1.3.2 rpoB基因突变
编码RNA聚合酶β-亚基的rpoB基因突变具有改善菌株代谢性能的潜力。赋予利福平抗性的rpoB基因突变能够增强抗生素的生产。这些突变可能模拟酶的ppGpp结合状态，从而启动次级代谢过程。
3.1.3.3 rpsL基因突变
导致K88E或K88R替换的rpsL突变可显著增加次级代谢产物生产。例如，K88E突变显著提高了放线紫红素的产量。在白色链霉菌中，rpsL突变体显著提高了盐霉素的产量，这归因于稳定期核糖体活性的提高。
3.1.3.4 核糖体回收因子(RRF)产量的增强
过表达编码核糖体回收因子的frr基因已被证明可以促进放线紫红素和阿维菌素的生产。在质粒中引入frr可大幅提高产量。
3.1.3.5 抗生素抗性突变的组合
组合赋予链霉素抗性、Rif
R和Gen
R抗性的突变可以大幅提高产量。获得额外抗生素抗性的菌株产生放线紫红素的水平显著上升，这与较高的ppGpp水平和发酵过程中稳健的蛋白质合成有关。
3.2 遗传工程
3.2.1 基因过表达
过表达正向调节基因是增强次级代谢产物产量的成熟策略。异源启动子的应用允许将途径调节与复杂的调节网络分离。通过在强启动子下引入额外拷贝的正向调节基因，可以显著提高泰乐菌素等代谢产物的产量。利用强组成型启动子的新整合载体可以增强特定抗菌化合物的产量。多学科方法如过表达外排基因、S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因和途径特异性激活因子，可大幅提高泰乐菌素产量。
3.2.2 基因敲除与下调
靶向链霉菌中负调节基因的破坏被广泛用于增强次级代谢产物生产。例如，破坏负调节基因可增加平板霉素和新生霉素的产量并激活隐性BGCs。细胞质外功能 sigma因子在次级代谢中起关键调节作用，删除特定ECF编码基因可显著促进次级代谢产物生物合成基因簇的表达。
3.2.2.1 组合调节策略
同时上调正向调节因子和下调负调节因子是提高目标产物产量的有效方法。通过协调正调节因子或共同过表达正调节基因，可以显著提高各种代谢产物的产量。敲除竞争副产物基因并过表达抗性基因，结合发酵优化，可大幅提高阿霉素产量。
3.2.3 次级代谢产物生物合成途径的基因组复制
增加抗生素生产中限速过程基因的数量可有效提高整体产量。利用细菌人工染色体载体克隆大片段DNA，结合链霉菌噬菌体的附着和整合系统，可将基因簇稳定插入噬菌体附着位点，从而提高产量并促进对隐性途径的探索。
3.2.4 靶向竞争途径以增强次级代谢产物生产
通过去除多个次级代谢产物生物合成基因簇来工程化基因组减小的变异株，可以显著改善异源表达，消除竞争前体和能量消耗带来的限制，从而提高目标产物的产量。
3.3 唤醒休眠的生物合成基因簇
3.3.1 通过胞外信号激活沉默生物合成基因簇
利用环境压力和激素样分子等胞外信号是增强天然产物产量或发现新化合物的有效方法。热休克、pH变化和高盐度等压力可以刺激沉默BGCs并促进次级代谢产物生产。例如，热休克和碱性pH冲击可分别提高放线菌素C和井冈霉素A的产量。引入GBL类似物等激素样信号分子也能显著提高抗生素效价。
3.3.2 在天然宿主中重配置生物合成基因簇途径
通过工程化启动子和核糖体重新配置生物合成途径是触发非活性BGCs的另一种方法。强组成型启动子或诱导型启动子可以显著提高代谢物产量。结合CRISPR/Cas9系统和RecET介导重组的CRISETR方法能够对天然BGCs内的启动子位点进行靶向修饰，从而大幅提高达托霉素产量。核糖体工程通过改变翻译保真度和全局调节网络也能激活隐性途径。
3.3.3 采用异源表达唤醒沉默生物合成基因簇
克隆和异源表达沉默或低表达的SMGCs有助于提高产量和分离新化合物。开发的特化链霉菌表达底盘菌株具有最小化的内源生物合成途径，能够实现高效异源表达。如天蓝色链霉菌M1154菌株和白色链霉菌J1074等表达宿主已被证明能有效表达隐性途径并提高次级代谢产物产量。
3.4 代谢工程
代谢工程通过优化代谢途径和调节网络或构建新途径来提高目标分子的产量。其重点在于将碳通量从初级代谢重定向至次级代谢。基因组规模代谢模型能够预测基因修饰的影响并指导合理的菌株设计。前体工程通过操纵糖酵解途径和戊糖磷酸途径来增强代谢物生产。脂肪酸前体、辅因子如S-腺苷甲硫氨酸的工程化也能有效提高次级代谢产物的产量。
3.5 优化培养条件的作用
发酵优化侧重于调整培养基成分、pH、温度和过程参数以最大化次级代谢产物生产。OSMAC方法通过在不同条件下培养目标细菌来发现新化合物。高温培养和热休克代谢物作为增强代谢物生产的手段，能够激活休眠基因并增加代谢物产量。此外，pH调整、氧气供应和光照等培养条件也显著影响代谢物产量。结合诱变和培养优化策略可以大幅提高特定生物活性代谢物的产量。
3.6 适应性实验室进化(ALE)
适应性实验室进化是一种基于进化的方法，通过在实验室环境中连续施加选择压力，产生具有增强抗性、代谢效率或次级代谢产物产量的突变体。ALE的应用主要集中在优化特定营养生长、适应挑战性条件以及产生新化合物或提高产物效价。结合ALE与共培养技术可以产生针对特定病原体具有活性的潜在新分子，或使突变体能够过量生产既定抗生素。
3.7 共培养技术
共培养技术通过复制其自然栖息地，利用微生物相互作用诱导沉默BGCs的表达，从而发现新型代谢物。将链霉菌与其他细菌、真菌或动物细胞共培养，能够刺激次级代谢并产生新化合物。然而，共培养在再现性、工业放大和生产生物体鉴定方面仍面临挑战。
3.8 挑战与未来展望
次级代谢产物生产优化面临调节网络复杂性、实验室发现向工业生产放大的可扩展性以及工程菌株代谢负担等挑战。未来的研究应侧重于整合系统生物学和人工智能，利用计算建模和机器学习优化微生物代谢和发酵过程。生物信息学工具在鉴定SMGCs方面具有重要作用。此外，探索沉默BGCs的未开发生物合成潜力、应用CRISPR-Cas技术和合成生物学、利用共培养技术以及开发可持续和具有成本效益的生产系统，将是未来的重要发展方向。
